【问题20】
小鼠脑脊液做lable free是否需要去除高丰度蛋白？
有没有案例或者介绍下蛋白组这块哪些样本需要去高丰度蛋白的？
【回答】：需要根据样本提取蛋白后SDS-PAGE结果评估。
一般血清血浆都需要除去高丰度蛋白，试剂盒成熟。
其余需要根据跑胶结果来判断。
【问题21】
iTRAQ与其他蛋白质组学技术的区别是什么？
【回答】：双向电泳是最早、最经典的蛋白质组技术，适用于大部分样本，只是对强酸或强碱性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果不好；另外由于各个样本需要单独跑胶，很难避免操作误差对结果的影响，可能导致定量不准确；但是双向电泳的服务价格相对便宜，可以用于样本差异的初步筛选；
DIGE在双向电泳基础上做了改进，引入了荧光标记物和内标，可以使定量更加准确；但该技术也是依据蛋白的等电点和分子量分离，因此对强酸或强碱性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果也不好。
iTRAQ、TMT、label-free和SILAC都是利用液质联用技术来寻找差异蛋白。其中，iTRAQ和TMT的原理和检测方法基本一致，只是使用了不同的标记物；TMT有10种标记物，可对多达10种不同样本进行分析，但是由于其标记物的质量数非常相近，因此必须使用超高分辨率的质谱才可以满足检测，这也必然会导致信号干扰更多，可能会影响定量的准确性；label-free是非标记的蛋白质组学技术，由于没有标记物，其定量需要依赖于操作和质谱仪的稳定性，该技术鉴定到的蛋白数目会少于iTRAQ技术，并且定量的准确性较差，优势是服务费用较低；SILAC是基于稳定同位素标记的细胞培养技术的蛋白质组学方法，利用不同的同位素培养基来培养不同组别的细胞，达到体内标记的目的，其定量准确性要比其他蛋白质组学技术更高；但是由于缺乏合适的同位素培养基，该方法基本只能用于可传代的哺乳动物细胞系。
从定量准确性、应用性等各方面综合考虑， iTRAQ技术已成为近年来利用最广泛的蛋白质组学技术。
【问题22】
iTRAQ实验对样本有何要求?
【回答】： 任何类型的样本都可以，如果是罕见物种，可以用近缘物种的数据库检索，也可提供转录组数据库来检索；一次上机，每组样本需要用200μg蛋白，但由于需要蛋白定量检测和预实验，因此每组样本所需的蛋白量大概在500μg左右；我公司负责蛋白质的提取，客户只需要提供足够的原始样本。
【问题23】
不同类型的样本做iTRAQ能否一次上机？
【回答】：不能。如果样品来源于不同物种，检索时就无法选择数据库，也就无法分析数据；即使是同一物种的样本，它们的蛋白种类和丰度也可能有很大差别(比如植物的根和叶)，将这些酶切肽段混合上机，其数据会相互干扰，导致蛋白定性和定量的不准确。
【问题24】
iTRAQ实验的数据采用不同数据库检索时，
各组间的比值为何是不同的？
【回答】：iTRAQ技术中不同标记物之间的比值与检索数据库、质谱电信号的噪音以及采集质谱时的随机性都有关。所以在使用不同数据库检索时，由于匹配肽段情况的不同，定量结果也有些许差异，但是总体变化趋势应是一致的。
【问题25】
iTRAQ定量蛋白质组做完实验后，能拿到什么结果呢？
可以直接用来发文章么？
【回答】：我们目前的iTRAQ定量蛋白质组的实验流程和结果都是受到业内顶级杂志JPR和MCP公认的，可以直接用于文章的发表。客户不仅可以拿到iTRAQ定量蛋白质组中的差异蛋白、蛋白的GO和KEGG归类信息、COG归类、不同样本的差异蛋白的聚类分析、差异蛋白的互作蛋白信息等，还可以提供客户指定的分析内容，提供个性化的服务要求，比如转录组和蛋白质组的关联分析。
【问题26】
对于iTRAQ下机数据，使用什么软件分析？
如何判断差异蛋白？
【回答】： 采用与Triple TOF 5600 plus配套的proteinpilot。已经有大量使用该软件发表的蛋白质组相关文献，是一款被广泛认可的蛋白质组鉴定、定量软件。我们对鉴定结果要求FDR≤1%，每个蛋白至少包含1个独有肽段。对于定量差异蛋白的评判标准，我们一般按照FC≥1.5，同时p-value≤0.05的标准过滤。
【问题27】
物种没有测序，能否做蛋白质组呢？
【回答】：因为当前大量的物种已经测序，预测了相应的基因，未测序的物种可以通过近缘物种的基因序列作为数据库进行蛋白质组的研究。
因此，一般来说，未测序物种可以考虑近缘物种的基因组序列作为数据库，可以做蛋白质组。
【问题28】
关于“样品重复”，技术重复和上机重复有什么区别？
发表的文章一般要求几次重复呢？
【回答】：一般建议做3次实验重复，如此可以在发表文章的过程中不被editor挑刺，从而影响发文章的速度。一般的文章会要求3次实验重复，如果iTRAQ后续做了大量的WB或ELISA验证，那么，2次实验重复也是必要的；仅作1次实验有风险，因为如果是实验过程出现问题，缺乏结果的评估，往往说服力不够，对文章发表可能构成影响，建议客户最好不要只作1次实验。
技术重复一般和上机重复非常类似，即上质谱的重复，即测试仪器的稳定性，判断系统误差等问题。这一说法主要和质谱仪器的发展进程相关，早期的仪器不是很稳定，同一个样本上机3次，结果差异较大，当前的上机重复仍然在一些JPR和MCP文章中可见，即沿用了早期的习惯。而应用型的文章中，上机重复或技术重复一般没有硬性规定，可以不做，如果做了当然最好，editor就不会在此处找你的问题。
【问题29】
为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白？
【回答】：这是学术性的问题，不是技术的问题。表达层次即RNA层次，RNA层次和protein层次的不一致性是一个公认的事实，通常相关性只有～0.5左右，即RNA和protein往往是两个不一样的概念。引起RNA和protein差异的原因很多，比如miRNA、lincRNA、circleRNA和E3 ligase等等
【问题30】
检索时为什么同一个编号对应了很多蛋白质？
【回答】：因为一个蛋白家族中常常含有多个同源性很高的蛋白质，这些蛋白质被酶切之后，很可能会产生很多相同的肽段，软件在进行定性分析时，就会将这些肽段均归于得分最高的那种蛋白质，其他同源蛋白不计分，并且这些同源蛋白都采用同一编号。
