导读：高通量、低成本的DNA测序成为后基因组时代的挑战之一。而单分子测序正承载着人们的殷切期望。近日，来自法国、西班牙和美国的研究人员在《自然—方法学》杂志上发表了机械法单分子测序平台的原理论证文章。
Sanger测序技术在DNA测序领域统治了近20年。人们对更快速更廉价测序方法的需求催生了其他技术的发展。近几年，新一代测序技术蓬勃发展，呈现百花齐放的态势。它们大规模并行监控DNA聚合酶或连接酶介导的荧光标记核苷酸的掺入。然而，由于读长有限，且预扩增步骤复杂，易引入偏向，第三代测序技术应运而生。
通过直接监控荧光标记核苷酸在单分子链上的掺入，第三代测序平台摒弃了预扩增，并实现了更长的读长。然而，这些单分子测序方法的不足之处是标记核苷酸的成本高，且错误率高（4-15%），因为其信噪比低，不检测或错误检测荧光信号。
在这篇文章中，作者们介绍了一种全新单分子鉴定和测序方法的原理论证，这种方法不依靠荧光，而依靠对DNA发夹延伸的测定，也就是说，它测定DNA发夹上与表面锚定的一端以及与磁珠结合的一端之间的距离。
研究人员将结合有DNA发夹的磁珠拉到表面，分子可解链。在这种开放状态下，它可与互补的寡核苷酸杂交，当拉力减小时这瞬间阻断了发夹解链。通过测定表面与磁珠之间的距离，您可以确定杂交的位置，这有着近乎单分子的精确度。这种方法可用于片段混合物中序列已知的DNA片段的鉴定，也可通过杂交或连接对未知的DNA片段进行测序。
作者认为，这种方法的主要优势在于检测到信号的性质，即DNA发夹的延伸。这种测定提供了连续信号，而不是大部分荧光方法的二元（on或off）信号。他们通过了非荧光成像和标准照相机实现了信号，成本应比现有方法低。此外，连续延伸信号的信息量比荧光信号更大。序列的杂交模式，而不仅仅是杂交存在，可作为DNA序列的指纹。
Single-molecule mechanical identification and sequencing
Fangyuan Ding, Maria Manosas, Michelle M Spiering, Stephen J Benkovic, David Bensimon, Jean-François Allemand & Vincent Croquette
High-throughput, low-cost DNA sequencing has emerged as one of the challenges of the postgenomic era. Here we present the proof of concept for a single-molecule platform that allows DNA identification and sequencing. In contrast to most present methods, our scheme is not based on the detection of the fluorescent nucleotides but on DNA hairpin length. By pulling on magnetic beads tethered by a DNA hairpin to the surface, the molecule can be unzipped. In this open state it can hybridize with complementary oligonucleotides, which transiently block the hairpin rezipping when the pulling force is reduced. By measuring from the surface to the bead of a blocked hairpin, one can determine the position of the hybrid along the molecule with nearly single-base precision. Our approach can be used to identify a DNA fragment of known sequence in a mix of various fragments and to sequence an unknown DNA fragment by hybridization or ligation.
文献链接：https://www.nature.com/nmeth/journal/vaop/ncurrent/full/nmeth.1925.html
