研究人员对鹦鹉基因组的特定区域进行单分子测序，同时采用第二代测序技术对数据进行了修正，论文发表在Nature Biotechnology杂志网站上。
单分子测序技术凸显读长优势 有望推动个体化医疗发展
单分子测序和第二代测序各有利弊
Duke大学神经学生物学家Erich Jarvis称，“单分子测序技术发展迅速，它能生成超长的读长，因而让基因组的拼装变得复杂。” Jarvis感兴趣的是调控鹦鹉模仿能力的基因序列，因为这些序列能为神经学科学家提供人类语言能力相关调控基因的信息。
Jarvis及其同事最初采用第二代测序来装配鹦鹉的基因组区域。由于一次性读长在100到400bp之间，基因组片段图谱需要数天时间才能拼装完成。不巧的是，某些鸣声学习基因的调控区域因读长不足而不能被拼装，尽管研究人员尝试了修改算法，仍无法解决这一问题。
单分子测序技术取得较大发展，2012年罗氏454和Pacific Biosciences的读长都达到了1000bp，而Pacbio的技术能一次生成2,250 到23,000bp的数据，大约在一天内拼装完整的基因组。
为了解决基因组测序时遇到的难题，Jarvis 和同事采用了PacBio RS仪器。不过他们发现Pacbio仪器在读取虎皮鹦鹉(Melopsittacus undulates)基因组时，难以精确解码某些复杂区域，仪器的错误率较高。Jarvis说，这种错误率几乎使他们难以用这些超长读长进行基因组装配。
单分子测序仪器能生成超长序列，极大的改善基因组和转录组的装配。不过，目前单分子测序读取的错误率较高，从而限制了其应用(如细菌重测序应用)。而第二代测序产生的读长虽然短，但精确性更高。
两种测序方法共同绘制
研究人员引入了一种修正算法和装配策略，应用第二代测序产生的短高保真序列对单分子测序进行了修正。他们成功将单分子测序(或称为第三代测序)仪的错误率从 15%减少到了小于0.1%。由此，科学家终于装配出了鹦鹉鸣声学习行相关基因的调控区域(如FoxP2基因和egr1基因)。
研究人员还对PacBio RS仪器生成的多种噬菌体、原核生物和真核生物的测序数据进行了修正，从而验证了该方法的可靠性。这一研究成果能帮助神经学科学家能更好地了解鸟类模仿和鸣唱的遗传学机制，同时也能为科学家提供有关人类交流和语言学习能力的遗传信息。
单分子测序的关键点
单分子测序的关键之一：DNA聚合酶
DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基，经过Watson配对后不同的碱基加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。这个DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，主要受激光对它的损伤的影响。
关键点之二：荧光标记位点
二代测序都标记在5’ 端甲基上，在合成过程中，荧光标记物保留在DNA链上，随DNA链的延伸会产生三维空间阻力导致DNA链延长到一定程度后会出现错读。
PacBio平台的碱基荧光标记在3‘端磷酸键。在DNA合成过程中正确的碱基进入时，在3’端磷酸键的标记是会随磷酸键断裂自动被打断，标记物被弃去，亦即合成的DNA链不带荧光标记，和天然的DNA链合成产物一致，可以达到很长的读长。
关键点之三：时空段概念
合成过程中，每次进入一个碱基，原始数据会实时地产生一个脉冲峰，每两个相邻的脉冲峰之间有一定的距离，也就是有一个时间段的概念。这个距离的长短与模板上碱基是否存在修饰有关，如果有碱基修饰，就像开车经过路障时，通过速度会减慢，导致两个相邻峰之间距离加大。根据这个距离的变化，可以判断模板相应位点是否出现碱基修饰，并且结果是实时的。甲基化就是一种主要的碱基修饰，PacBio技术不仅可以提供序列信息，还可提供实时信息了解模板修饰的情况，用于甲基化等碱基修饰研究。
单分子测序技术与个体医学
基因组学起源于上世纪70年代，是以研究生物染色体及基因的核苷酸序列为主的科学。自上世纪90年代以来，随着以基因芯片为代表的高通量研究方法的出现，基因组学研究的内容得到了进一步的充实，其范围也逐步地延展到对正常或疾病状态下的基因功能的整体分析、染色体结构或基因的变异性检测如单核甘酸多态性、拷贝数变异、杂合性缺失，等等。
单分子测序技术是一项应用前景非常光明的技术，它会为基因组学和个体医学的发展带来划时代的影响。与传统的高通量技术的间接检测生物分子相比，单分子测序能够更直观地观察与测量DNA／RNA分子的数量(数字化基因表达)和序列结构，此外，随着这一技术的成熟，单个基因组的测序价格会急剧下降，专业人士预测价格降到1000美元以下，基因组测序有望走向临床诊断，从而推动个体化医疗的发展。
单分子测序技术如何走向个体化医疗领域？哈顿资本执行董事王进建议，基因测序机构应该加强与临床医学界合作，需要有系统生物研究，药物基因组学以及生物统计的思维、手段和工具，要特别注重吸纳复合型高端人才，开展更多开放式的合作与探索。另外政府和投资界要扶植支持有核心技术的测序服务公司。并与第三方临床检测公司进行合作。
目前，全球范围内各大生物技术企业在单分子测序领域上演激烈的角逐。美国加利福尼亚州山景市Complete Genomics公司推出的纳米珠系统测序仪（arrayed nanoball system）；Pacific Biosciences公司推出第三代测序平台——PacBio RS单分子实时测序系统；英国Oxford Nanopore Technologies公司宣布推出了基于纳米孔的基因组测序仪；Helicos Biosciences公司推出Heliscope单分子测序仪。
基因组测序在药物上应用
药物基于组学研究揭示，药物代谢相关基因的多态性与药物疗效、体内分布和毒副作用密切相关；而肿瘤基因组学的研究表示，一些肿瘤等疾病的致病基因多态性，也决定了某些针对特定靶标的药物疗效的有无或高低。通过基因早期诊断，寻找基因差异，可确定肿瘤患者发病个体化情况，从而提供个体化治疗方案。个体间药物作用可相差几十倍，甚至数千倍以上。一些异常的药物反应是由许多特殊基因构成的特定基因型所决定的，越来越多的靶标与特定药物的有效性和毒副作用密切相关。
单分子测序的研究进展
单分子测序视频
