凋亡检测操作流程
二、 BrdU检测凋亡细胞DNA断裂片段
相关试剂及组分：
一步法: APO-DIRECT试剂盒（货号：556381）：
PartA（4°C保存） PartB（-20°C保存）
PI/RNase A Solution FITC-dUTP
Reaction Buffer TdT Enzyme
Rinsing Buffer Negative Control Cells：已固定细胞
Wash Buffer Positive Control Cells：已固定细胞
二步法: APO-BRDU™试剂盒（货号：556405）：
PartA（4°C保存） PartB（-20°C保存）
FITC-Labeled Anti-BrdU mAb Br-dUTP
PI/Rnase staining buffer
Reaction Buffer TdT Enzyme
Rinsing Buffer Negative Control Cells：已固定细胞
Wash Buffer Positive Control Cells：已固定细胞
实验操作（适用于APO-DIRECT试剂盒）：
1. 细胞固定：
1) 用PBS洗细胞后，将细胞重悬于1%多聚甲醛的PBS溶液中，浓度为1-2x106/ml，冰浴30-60分钟。
2) 300xg离心5分钟，弃上清。
3) 用5ml PBS洗细胞两次，重悬于70%乙醇中，浓度为1-2x106/ml，冰浴30-60分钟。（70%乙醇
细胞悬液在-20°C放置12-18小时后进行细胞凋亡检测，得到的效果最好。细胞可以在-20°C保存几
个月。）
2. 配制染色液，现用现配。
DNA标记液 1个测试 5个测试 10个测试
Reaction Buffer 10.00μl 50.00μl 100.00μl
TdT Enzyme 0.75μl 3.75μl 7.50μl
FITC-dUTP 8.00μl 40.00μl 80.00μl
蒸馏水 32.2500μl 161.25μl 322.50μl
总体积 51μl 255μl 510.00μl
3. 细胞染色：
1) 取离心管和Falcon试管，按标本顺序编号。
2) 取1x106细胞悬液加入离心管中，300xg离心5分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。
质控细胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：混匀后取1ml（细胞数约 1x10^6/ml）加入离心管中，300xg离心5分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。
3) 每管各加入1.0ml Wash Buffer，洗细胞两遍，弃上清。
4) 加入DNA标记液50μl重悬细胞。
5) 37°C温育60分钟（或者室温过夜），每15分钟摇匀一次。（非质控细胞37°C温育时间需根据不同 情况有所凋整。）
6) 每管加入1.0ml Rinse Buffer，300xg离心5分钟，弃上清。重复两遍，弃去上清。
7) 加入0.5ml PI/RNase A Solution，混匀。若细胞浓度低，可将用量调整到0.3ml。
8) 室温避光孵育30分钟。
9) 3小时内上流式细胞仪测定结果。
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