从餐巾纸上出现的质粒克隆技术,值得每一位科研人员好好学习!

2022-03-24 10:54 · 生物探索

从餐巾纸上出现的质粒克隆技术:通过DNA连接酶共价连接,筛选具有抗生素耐药表型的细菌菌落。

1972年11月,在夏威夷檀香山威基基海滩的一家饭馆中,来自匹兹堡大学、华盛顿大学和德克萨斯大学的一群科学家(包括Stanley Falkow,Stanley Cohen,Herbert Boyer和Charles Brinton)在饭馆的一张餐巾纸上写下了利用新发现的EcoRI来进行质粒克隆试验的疯狂想法(图1)。1973年初,这群科学家们就开始试验验证,真正的试验比想象中还要顺利。科学家们成功将EcoRI内切酶切割产生的R6-5质粒DNA片段在体外随机结合,然后通过DNA连接酶共价连接,将所得混合物中的DNA转入氯化钙处理的大肠杆菌中,并在含有抗生素的培养基上筛选具有抗生素耐药表型的细菌菌落。

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图1 餐桌上提出新想法(图片来源:PNAS)

正如后来Paul Berg的评论所说:“不需要天才就能发现,如果你能创造出互补的人工末端,两个DNA分子就会结合在一起”。1973年11月,一篇名为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids In Vitro”的文章登上PNAS,正式宣布将要影响生物学历史的分子克隆技术的诞生(图2)。

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图2 研究成果(图片来源:PNAS)

现代分子克隆技术一般包括5个基本的步骤:载体和插入片段的制备、连接、转化、筛选以及验证。实验过程中的每一步都是分子克隆成功的关键。例如在载体和插入片段的制备阶段,经常会遇到酶切不完全、酶切带型异常等情况,这些看似简单的问题,却也困扰着一代又一代的科研人员。

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题图来源:Science,仅用于学术交流。

排版|乔维钧