动物细胞融合

细胞融合指的是两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的现象，在自然情况下，受精过程及某些病变组织中的多核细胞均属于融合现象。1961年Barski在研究中观察到组织培养体细胞融合现象。1962年Okada首先成功地用仙台病毒诱导了细胞融合，此后引起了不少学者研究细胞融合地兴趣。30多年来，细胞融合技术有了很大进步，如在动物或植物种内或种间的细胞杂交，甚至在动物细胞和植物细胞之间的细胞杂交等方面取得了很多的成果。目前，细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞工程、细胞免疫和肿瘤等的重要手段之一。

一、目的与要求

了解细胞融合的原理及初步掌握的细胞融合的方法。

二、原理

在人工条件下，只有在某些诱导物（如仙台病毒、聚乙二醇等）的诱导下，使亲本细胞膜发生一定的变化，才能使两个或多个或更多的细胞融合。细胞融合过程，首先是在诱导物的作用下出现细胞凝集现象。然后，在细胞粘连处发生融合，而成为多核细胞。最后，经有丝分裂，细胞核进行融合，遂形成新的杂种细胞。

用人工方法诱导的细胞融合可形成两种类型的双核或多核细胞，由同一亲本的细胞融合形成的细胞称之为同核体（homocaryons），由不同亲本细胞融合形成的则称之为异核体（heterocaryons）。细胞融合后的多核细胞大多只能存活一段时间（约十几日）就相继死亡，而只有双核的异核体才能存活下来。存活下来的异核体经有丝分裂，染色体合并在一个细胞核内，形成杂种细胞。

为便于杂种细胞的筛选，细胞融合时所用的亲本细胞中，其中一个常选用能在体外增殖但有酶缺陷的细胞，如缺乏次黄嘌呤鸟便嘌呤核糖基转移酶（HPRT）或核苷激酶（TK）。而另一亲本细胞则选用离体后不能再生增殖的细胞。将这两种细胞进行融合后，用HAT培养基培养。后一种亲本的未融合细胞和同核体由于离体后不能生长而死亡。前一种亲本的未融合细胞和同核本（离体细胞能在全养培养基中生长增殖）由于HAT培养基中所含的氨基喋呤可阻断其DNA合成的主要途径，而这种细胞又因为缺乏HP－RT和TK不能利用培养基中的外源核苷酸原料（次黄嘌呤）而死亡。因而只有经过融合的异核体（杂种细胞），由于酶的补偿作用，能在HAT培养基中生存，从而被筛选出来。

三、实验内容

1、细胞融合

2、融合细胞的识别

四、实验步骤

（一）脊椎动物细胞融合

0.混合两种亲本细胞

取小鼠腹腔巨噬细胞或鸡红血球悬液1ml(107细胞/ml),IB-RS-2细胞1ml(106细胞/ml)注入5ml具塞尖底离心管中，混和两种亲本细胞后，取出混和液0.2ml，用生理盐水稀释5倍，作对照。

1.细胞融合

将上述剩余的两种亲本细胞的混合液以1500rpm/min的转速离心5分钟，去掉大部分上清液，留下0.1ml液体将沉降的细胞分散于其中，制成细胞悬液。轻轻摇动试管、并逐滴加入后在37℃下预热的40％的聚乙二醇溶液0.4ml。将此悬液置于37℃水浴中温育90秒钟后，缓慢的加入无血清培养液5ml,以中止PEG的作用。此后盖塞，并慢慢的倾转离心管4～5次。以1500rpm/min离心5分钟。去除大部分上清液，留下约0.1ml液体悬浮细胞。在此悬浮液中加入5ml完全的E-MEM培养液（系指加入血清的培养液），混匀后，取出0.4ml悬液作观察用

2.细胞培养

将细胞作4倍稀释，混匀，以每孔0.5ml分装于24孔培养板或每孔0.1ml分装于96孔培养板，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。

3.制片

将步骤1和2所留下的两种亲本细胞的混合液和融合后的细胞悬液分别涂片（每组涂3张），迅速干燥，甲醇固定，Giemsa染液进行染色、水洗、干燥。镜检，观察融合细胞。或者将上述两种细胞悬液分别滴于载玻片上，加盖盖玻片后，在相关显微镜下直接进行观察。

4.观察

先观察对照组，从形态上识别两种亲本细胞并观察其中有无融合细胞。此后观察实验组，找出融合后的多核细胞，双核细胞，并区分同种融合与异种融合细胞。

（二）原生动物细胞融合

原生动物四膜虫的个体较大，四周有很多纤毛，有大小两个细胞核，眼虫个体比四膜虫小，头部具有叶绿体。本实验采用这两种亲本细胞仅是为了便于制备大量细胞和便于识别异型多核细胞。

1．混合两种亲本细胞

向尖头离心管内分别加入眼虫悬液、四膜虫悬液各2ml，混和细胞。取出混合液0.2ml，滴片观察两种亲本细胞。

2．细胞融合

将上述两种细胞的混合液以1000转/分的转速离心2分钟，快速倒去或吸去上清液，剩下0.1－0.2ml液体，摇动离心管，分散细胞，制成细胞悬液。逐滴加入37°C，40％的聚乙二醇溶液0.4－0.8ml。离心管置37°C水浴90秒钟，缓慢加入4°C、PBS液4ml，以终止PEG的作用。盖橡皮塞，缓慢倾转离心管4－5次。1000转/分，离心2分钟，除去上清液，留下0.1－0.2ml液体悬浮细胞。加入PBS液3ml，混匀细胞，滴片观察。

3．观察

先观察混和细胞，以识别两种亲本细胞。然后观察融合细胞，并画出不同类型的融合细胞。