层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。它是利用混合物中各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，在物质经过两相中，不断地进行交换、分配等过程。任何层析都具有两个相，即固定相和流动相。固定相固定不动，流动相对固定相作单相的相对运动，从而推动样品中各组分通过固定相向前移动。由于混合物中各组分的理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断的吸附－解吸－吸附－解吸作用，造成混合物中各组分距离不等的迁移，从而达到分离的目的。层析技术的分类方法有多种。根据两组分所处的物理状态可分为：气相层析和液相层析。气相层析指的是流动相为气体，固定相可以是液体（气液层析）也可以是固体（气固层析）；液相层析指的是流动相为液体，固定相可以是液体（液液层析）也可以固体（液固层）。根据层析的方式可分为：纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析指的是滤纸作固定相进行的层析；薄层层析是将固定相研成粉末，再压成薄膜或薄板，类似于纸层析；柱层析是将固定相装于柱内的层析。根据层析的原理可分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。下面根据层析的原理，依次介绍这些层析。
一、吸附层析
一、基本原理
任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质，在另一相表面上密集的现象，称为吸附。其中，能够将其它物质聚集到自已表面上的物质，称吸附剂；聚集于吸附剂表面的物质称吸附物。当混合物随流动相流经由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对不同的物质具有不同的吸附力，从而使不同组分的移动速度也不相同，最终达到分离的目的。由于吸附过程可逆的，因此被吸附物在一定条件下可以解析出来。假如混合物中含A、B两种物质，在洗脱过程中，随着流动相流经固定相，它们会连续不断地分别产生解吸－吸附－解吸－吸附的现象。由于洗脱液和吸附剂对A、B的解吸（溶解）与吸附力不同，A和B的移动速度也就不同。溶解度大而吸附力小的物质走在前面；溶解度小而吸附力大的物质走在后面。经过一段时间以后，A、B两种物质就会分开。
二、常用吸附剂的类型及特性
层析用的吸附剂应该满足以下要求：在层析溶剂中不溶解；对洗脱液及被分离物质呈化学惰性；吸附能力强，同时具吸附可逆性；分子扩散速度应尽可能地快。常用吸附剂是多孔结构的。粒子大小、形状以及孔的结构是影响层析的基本因素。下面简要介绍几种常用吸附剂：
1．硅胶 硅胶略带酸性，适用于中性和酸性物质的分离，如氨基酸、糖、脂类等，其优点是：化学隋性强、吸附量大、制备容易。
2．氧化铝 氧化铝略带碱性，适用于中性及碱性物质的分离，如生物碱、类固醇、维生素、氨基酸等。其优点是：吸附量大、价格低廉、分离效果好。
3．活性炭 活性炭大多以木屑为原料。根据其粗细程度可分为三种：粉末活性炭：颗粒极细，呈粉末状，吸附量及吸附力大；颗粒活性炭：颗粒较大，比表面积及吸附力都比粉末活性炭小；锦纶－活性炭：以锦纶为粘合剂，将粉末活性炭制成颗粒，比表面积介于粉末活性炭和颗粒活性炭之间，吸附能力较两者弱。
㈠基本原理
分配层析是利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配系数不同而使物质得到分离的方法。
分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时，该溶质在两种溶剂中所具浓度之比。不同的物质因其在各种溶剂中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在一定温度下，分配系数可用下式表示：
Kd = C2/C1
式中，Kd为分配系数；C2是物质在固定相中的浓度；C1是物质在流动相中的浓度。分配系数与温度、溶质及溶剂的性质有关。
在分配层析中，大多选用多孔物质作为支持物，利用它对极性溶剂的亲和力，吸附某种极性溶剂作为固定相；用另一种非极性溶剂作为流动相。如果把待分离的混合物样品点在多孔支持物上，在层析过程中，非极性溶剂沿支持物流经样品点时，样品中的各种混合物便会按分配系数大小流动相而向前移动。当遇到前方的固定相时，溶于流动相的物质又将与固定相进行重新分配，一部分转入固定相中。因此，随着流动相的不断向前移动，样品中的物质便在流动相和固定相之间进行连续地、动态地分配。这种情形相当于非极性溶剂从极性溶剂中对物质的连续抽提过程。由于各种物质的分配系数不同，分配系数较大的物质留在固定相中较多，在流动相中较少，层析过程中向前移动较慢；相反，分配系数较小的物质进入流动相中较多而留在固定相中较少，层析过程中向前移动就较快。根据这一原理，样品中的各种物质就能分离开来。分配层析中应用最广泛的多孔支持物是滤纸，称纸上分配层析。其次是硅胶、硅藻土、纤维素粉、微孔聚乙烯粉等。
㈡纸上分配层析
纸上分配层析（纸层析）设备简单、价格低廉，常用于氨基酸、肽类、核苷酸、糖、维生素、有机酸等多种小分子物质的分离、定性和定量。纸层析是以滤纸作为惰性支持物。滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸收22％左右的水，而且其中6％～7％的水是以氢键形式与纤维素的羟基相结合，在一般条件下较难脱去。而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力很小，所以纸层析是以滤纸的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。当流动相沿纸经过样品点时，样品点上的溶质在水和有机溶剂之间不断地进行分配，一部分样品随流动相向前移动，分配，其中的一部分溶质由流动相又进入水相（固定相）。随着流动相的不断流动，各种不同组分按其各自的分配系数，不断地在流动相和固定相之间进行分配，并沿着流动相向前移动，从而使各种物质得到分离和提纯。
离子交换层析
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是广泛应用于微生物发酵、医药、化工和水质的处理等，分离的对象多为小分子物质。
一、基本原理
离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间具有引力的作用。离子交换层析的固定相是载有大量电荷的离子交换剂；流动相是具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。当混合物溶液中带有与离子交换剂相反电荷的溶质流经离子交换剂时，后者即对不同溶质进行选择性吸附。随后，用带有与溶质相同电荷的洗脱液进行洗脱，被吸附的溶质可被置换而洗脱下来，从而达到分离混合物中各种带电荷溶质的目的。离子交换剂按其所带电荷的性质分为阴离子交换剂和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂本身带有正电荷，可以吸引并结合混合物[的物质；阳离子交换剂本身带有负电荷，可以吸引并结合混合物中带正电荷的物质。
二、离子交换剂的类型
常用的离子交换剂主要有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖或离子交换琼脂糖凝胶等。
1．离子交换树脂：是由苯乙烯作为单体，苯二乙烯作为关联剂，进行聚合和交联反应生成的具有三维网状结构的高聚物。其上再引入所需要的酸性基团或碱性基团。带酸性基团的属阳离子交换树脂；带碱性基团的属阴离子交换树脂。
2．离子交换纤维素：离子交换纤维素对蛋白质和核酸的纯化极为有用，因为这生物大分子不能渗入到交联的结构中，因此不能在一般的树脂上被分离。而纤维素之所以具有分离、纯化高分子量化合物的能力，是因为它具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，大分子可以自由通过。因此对生物大分子来说，纤维素的交换能力比离子交换树脂要大，同时纤维素来源于生物材料，洗脱条件温和，回收率高。离子交换纤维素常用的有两种，一种是二乙基氨基纤维素，即DEAE－纤维素，属阴离子交换剂。另一种是羧甲基纤维素，即CM－纤维素，属阳离子交换剂。
3．离子交换葡聚糖或离子交换琼脂糖凝胶：这是将离子交换基团连结于交联葡聚糖或琼脂糖上而制成的各种交换剂。交联葡聚糖和琼脂糖具有三维网状结构，因此这种交换剂既有离子交换作用，又有分子筛作用。
凝胶层析
凝胶层析又称凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析等。它是六十年代发展起来的一种快速简便的分离方法。目前已在生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域中得到应用。
一、基本原理
是指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。固定相是凝胶。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则被排阻于凝胶颗粒之外，因而具有分子筛的性质。当混合物样品加入到凝胶的层析柱中时，样品将随洗脱液的流动而移动。这时的样品一般作两种运动：一是随洗脱液垂直向下移动；二是作不定向扩散运动。分子量小的物质，在不定向扩散中可以进孔内部，然后再扩散出来，故流程长，通过柱子的速度慢，一般后流出层析柱；分子量大的物质，由于不能进入到凝胶孔内部，只能在凝胶颗粒之间移动，故流程短，先流出层析柱。这样，分子量大小不同的物质就会因此得到分离。凝胶孔隙中的水称内水，用Vi表示。凝胶颗粒空隙之间的水称外水，用Vo表示，层析柱中凝胶颗粒的体积用Vg表示，柱床的总体积以Vt表示，即
（1）完全排阻的大分子 （2）中等分子
（3）完全渗透的小分子 （4）吸附分子
二、常用凝胶的种类及特性
常用的凝胶主要有琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖－葡聚糖复合凝胶等。
1．琼脂糖凝胶：是从琼脂中分离出来的天然凝胶，由D－半乳糖和3、6－脱水－L－半乳糖交替结合而成。其商品名因生产厂家不同而异，如Sepharose（瑞典）、 Sagavac（英国）、Bil-Gel（美国），每一品名又有不同的型号。琼脂糖凝胶的优点是凝胶不带电荷，吸附能力非常小。主要用于分离分子量40万以上的物质，如核酸、病毒等。
2．交联葡聚糖凝胶：其基本骨架是葡聚糖。瑞典出品的商品名为Sephadex，国产的商品名为Dextran。不同型号的凝胶用“G”表示，从G－25～G－200。“G”后面的数字表示每10克干胶的吸水量，“G”值越大，表示凝胶的网孔越大。可根据待分离混合物分子量的大小，选用不同“G”值的凝胶。
3．聚丙烯酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺先合成线性聚合物，再以交联剂共聚交联而成。以 “P”表示，从 P－2～P－300。“P”后的数字×1000表示分子量的排阻极限。
4．琼脂糖－葡聚糖复合凝胶：商品名为Superdex，是把葡聚糖凝胶，通过交联剂交联到琼脂糖上，因此具有二者的优点。
三．影响凝胶柱层析的主要因素
1．层析柱的选择与装填 层析柱的大小应根据分离样品量的多少以及对分辩率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
2．洗脱液的选择 洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。
3．加样量 加样量的多少应根据具体的实验而定；一般分级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1%～5%左右，而分组分离时加样量约为凝胶柱床体积的 10%～25%左右。
4．凝胶的再生：在凝胶或层析床表面常有一些污染，必需作适当处理。葡聚糖凝胶柱可用0.2N NaOH 和 0.5N NaCl的混合液处理，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶遇酸、碱不稳定，故常用盐溶液处理。
亲和层析
生物体内有许多高分子化合物，具有和某些对应的专一分子可逆结合的特性。例如，酶蛋白和辅酶、抗原和抗体、激素与其受体等都具有这种特性。这种生物大分子和配基之间形成专一的可解离的络合物的能力称为亲和力。亲和层析的基本过程是，把欲分离的可亲和的一对分子的一方作为配基，在不伤害其生物功能的情况下，与不溶性载体结合使其固定化，然后装入层析柱。把含有欲分离物质的混合液作为流动相，在有利于固定相的配基和欲分离物质之间形成络合物的条件下进入亲和层析柱。这时，混合物中只有能与配基形成络合物的物质才被层析柱吸附，不能形成络合物的杂质从柱中直接流出。然后改变流过层析柱的溶液，促使配基与亲和物质解离，从而释放出亲和物质来。亲和层析的优点是条件温和、操作简单，专一性强、效率高，尤其是分离含量少而又不稳定的的活性物质最为有效。亲和层析的局限性是，不是所有的生物高分子都有特定配基，所以使用范围较窄；另外针对分离的对象必需制备专一的配基和选择特定的层析条件。
