【摘要】
背景：目前多采用酶解法分离成年大鼠心肌细胞，但在灌流装置、灌流液体和灌流方法等方面的差异较大，且多以单个细胞的急性分离为目的，仅适于进行电生理研究。
目的：建立稳定的改良成年SD大鼠心肌细胞分离方法，使之适于进行原代培养和研究。
设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2008-03/09 在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心完成。
材料：8～10周龄雄性SD大鼠30只，由同济医学院实验动物中心提供，2型胶原酶、蛋白酶和不含脂肪酸的牛血清白蛋白分别为美国Worthington公司、美国Sigma公司和德国Merck公司产品。
方法：SD大鼠麻醉后，快速取出心脏，采用改良的Langendorff灌流装置行主动脉逆行灌注，无钙Krebs-Henseleit缓冲液（KH液）非循环灌流4 min，0.6g/LWorthington 2型胶原酶联合0.03g/L蛋白酶消化约15 min，剪下心室组织于消化液和10g/L牛血清白蛋白的混合液中，剪碎后于37℃振摇孵育10 min，200μm尼龙网过滤，500 g离心1 min，梯度复钙，自然沉降。
主要观察指标：心肌细胞的形态观察、活力测定、产量。
结果：复钙后的杆状存活心肌细胞得率为（73±5.6）％（n＝30），其中90％以上的杆状心肌无明显搏动，横纹清晰。每只大鼠心脏的平均存活心肌细胞产量为（4.2±0.4）×106。
结论：经过改良的Langendorff逆行主动脉灌流酶解法分离成年大鼠心肌细胞，可稳定获得高比例的存活心肌细胞并用于原代培养和细胞/分子生物学研究。
【关键词】 心肌细胞；细胞分离；细胞培养；大鼠
A modified method for isolation of adult rat cardiomyocytes
Liao Hua1 , Mi Tao2 , Tu Zhi-ye1 , Chen Li-li2, Guo Xiao-mei1
1Department of Cardiology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030, China
2Department of Gerontology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030, China
Correspondence to: Chen Li-li, Doctor, Associate professor. E-mail: lilic_8@hotmail.com
Abstract
BACKGROUND: At present, adult rat cardiomyocytes are usually isolated by enzymolysis with different kinds of perfusion apparatuses, collagenases and methods. It is mainly aimed at emergent isolation of single cardiac myocyte and only appropriate for electrophysiologic study.
OBJECTIVE: To develop and optimize a stable adult Sprague-Dauley rat cardiomyocytes isolation method for primary culture and research.
DESIGN, TIME AND SETTING: The cytology in vitro experiment was performed at the Molecular Cardiology Center, Department of Cardiology, Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology from March to September 2008.
MATERIALS: Thirty male Sprague-Dawley rats aged 8-10 weeks old were obtained from laboratory animal center, Tongji Medical College. Collagenase, type 2, protease and BSA, fatty acid free were purchased from Worthington Biochemical Corporation, Sigma Corporation and Merck Corporation, respectively.
METHODS: After successful anesthesia, the rat heart was quickly excised out with sufficient length of aorta and perfused by modified Langendorff system: firstly with calcium-free Krebs-Henseleit buffer (KHB) in nonrecirculating manner for 4 min, and then by recirculation of KHB with 0.06% collagenase and 0.003% protease for about 15 min, thereafter ventricular tissue was minced and incubated in digestion medium with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) at 37℃ for 10 min. After centrifuged at 500 g for 1 min, the isolated cells were performed gradient calcium reintroduction and allowed to pellet via gravity.
MAIN OUTCOME MEASURES: Morphology, vitality and yield of isolated rat cardiomyocytes.
RESULTS: A large amount of rod-shaped rat cardiomyocytes with clear cross striations and high activity (73%±5.6%, n=30) were acquired after calcium reintroduction, more than 90% of rod-shaped cardiomyocytes were quiescent. The average yield of viable cardiomyocytes was (4.2±0.4)×106 per heart.
CONCLUSION: A high yield of cardiomyocytes isolated by aorta retrograde perfusion with digestive enzymes using modified Langendorff system can be aquired stably and applicable for primary culture and cell/molecular biology study.
0 引言
1912年Burrows[1] 首次对鸡胚心脏组织进行培养并观察到单个细胞的迁移现象。43年后，Cavanough[2] 首次对鸡胚心肌细胞进行了分离和保存。Harary 等[3] 于1960年利用胰蛋白酶对幼年大鼠心肌细胞成功进行了分离和培养，开创了应用酶解法分离哺乳动物心肌细胞的先河。然而，胚胎期和幼年心肌细胞等非成熟细胞与成熟心肌细胞相比无论在结构还是功能上都存在着很大的差异，因此Kono[4] 和Powell[5] 又先后应用酶解法对成年大鼠心肌细胞进行了分离，并由Jacobson[6] 于1977年成功进行了成年大鼠心肌细胞的培养。酶解法也由此成为了获得成熟心肌细胞的主要方法。近年来，随着心脏电生理研究的不断深入和细胞/分子生物学研究在心血管研究领域的不断普及，成熟心肌细胞的分离培养方法作为重要的研究手段也越发显得重要[7-8]。然而，由于迄今为止尚无统一的分离方法，不同实验室分离的心肌细胞的质和量相差悬殊，且国内多以单个心肌细胞的电生理研究为目的进行急性分离，不适于进行细胞/分子生物学研究[9-13]。实验在总结前人方法的基础上，对灌流装置、灌流液体和灌流方法等进行了改良，建立了适用于原代培养的成年大鼠心肌细胞的分离方法。
1 材料和方法
设计：细胞学体外观察。
时间及地点：于2008-03/09 在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心完成。
材料：8～10周龄雄性SD大鼠30只，由同济医学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（鄂）2004-0007。实验过程中对动物的处置符合2005年湖北省人大常委会颁布的《湖北省实验动物管理条例》中的规定[14]。
主要试剂与仪器：
主要试剂与仪器 来源
2型胶原酶 Worthington公司
蛋白酶 Sigma公司
牛血清白蛋白（不含脂肪酸） Merck公司
超纯水 Millipore公司
HEPES Sigma公司
台盼蓝 Sigma公司
葡萄糖 国产分析纯
NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、KH2PO4、MgSO4 国产分析纯
Langendorff灌流系统 自制
恒流泵 上海沪西分析仪器厂
恒温水浴锅 江苏金坛宏凯仪器厂
实验所需各种液体的基本组成成分见表1。KH液配成10×的储存液，临用前加葡萄糖并过滤除菌；无钙KH液加入0.6g/LWorthington 2型胶原酶、0.03g/L蛋白酶和50 μmol/L CaCl2 即成为酶消化液；相同的酶消化液中加入10g/L牛血清白蛋白（不含脂肪酸）配成温育液；无钙KH液中分别加入200，500 μmol/L和1 mmol/L的CaCl2 成为梯度复钙液。
表1 实验所需各种液体的基本组成成分（mmol/L）
液体 NaCl KCl MgSO4 KH2PO4 NaHCO3 Glucose HEPES CaCl2 pH
KH液 118 4.7 1.2 1.2 25 11 10 － 7.25
酶液 118 4.7 1.2 1.2 25 11 10 0.005 7.25
温育液 118 4.7 1.2 1.2 25 11 10 0.005 7.25
复钙液 118 4.7 1.2 1.2 25 11 10 0.2～1 7.25
实验方法：
系统准备：准备好所有与实验有关的仪器和器械，将改进后的Langendorff 灌流系统，见图1。置于超净台内，37℃预热灌流系统，体积分数为70％乙醇灌洗15 min，然后用无菌去离子水清洗10 min，每次实验结束后也应用体积分数为70％的乙醇和去离子水清洗系统，确保其洁净。实验开始前所有灌流液首先氧饱和30 min。在动物麻醉开始前5 min加入无钙KH液循环灌流，调整流速为3mL/min，同时用100％O2继续饱和，注意排空气泡。
心脏获取：实验大鼠在麻醉前20 min予以腹腔注射肝素1000U/kg，麻醉采用0.3％（w/v）戊巴比妥钠腹腔注射，剂量为2mL/100g。麻醉成功后迅速开胸暴露心脏，自主动脉根部约5 mm处剪断后将心脏置于预冷的4℃无钙KH液中，可见心脏自主搏动数次排出心腔内血液。适当去除周围组织后迅速暴露主动脉并将其逆行插入灌流套管，动脉夹固定后再用丝线在其下方结扎固定。
分离方法：调整流速为6mL/min，无钙KH液非循环灌流4 min。换用含有50 μmol/L CaCl2 的酶液消化约15 min，流速8mL/min，待到心脏外观发白、肿大并塌陷时剪下心室组织于相同的消化液和10g/L牛血清白蛋白的混合液中，用眼科剪将其剪碎成1mm×1mm×1mm左右的组织块，吸管轻轻吹打后于37℃振摇孵育10 min。200μm尼龙网过滤，500 g离心1 min，去除上清液，沉淀依次用含有200，500和1 mmol/L CaCl2 的梯度复钙液复钙，每次复钙后自然沉降10 min，小心去除上清后再次行梯度复钙。复钙完成后用含有牛血清白蛋白、肌酸、牛磺酸、肉毒碱、胰岛素等添加物的M199培养基按照文献报道的方法进行无血清原代培养[15-17]。
主要观察指标：①分离的成年大鼠心肌细胞的形态学观察。②心肌细胞的活力检测。③心肌细胞的产量。
设计、实施、评估者：实验设计为第四、五作者，实验实施为第一、二、三作者，实验评估为全体作者，所有参与实验者均经过系统培训，实验过程中未使用盲法评估。
2 结果
2.1 形态学观察：分离即刻的心肌细胞，倒置显微镜下观察可见约90％的细胞呈长杆状，为存活细胞。少数细胞皱缩成圆形或椭圆形，为死细胞。复钙后，约3/4的心肌细胞维持杆状形态，胞膜完整，纹理清晰，其中约10％的细胞发生自发性收缩，其余细胞呈静息状态，为钙耐受细胞。
2.2 细胞活力检测：复钙后的细胞经锥虫蓝染色检测，（73±5.6）％（n＝30）为拒染的活性细胞，其余细胞为蓝染的死细胞。
2.3 心肌细胞产量：30只成年SD大鼠的心肌分离结果显示，平均每个心脏的存活心肌细胞产量为（4.2±0.4）×106 ，无血清培养可生长7d以上。
3 讨论
酶解法用于成年大鼠的心肌分离已有40年的历史，但至今仍无统一的方法可循[18-19]。北京医科大学龙西林等[20]于1991年率先在国内报道成年大鼠的心肌分离方法，迄今为止也仅有少数单位初步建立了可用于原代培养的心肌细胞分离方法[21-23]。究其原因，一是影响心肌分离效果的因素很多，Langendorff 灌流系统的稳定性、心脏获取和悬挂的速度、水质、灌流液的温度、pH值和流速、酶的选择、用量和消化时间、梯度复钙的浓度和方法、操作者的熟练程度等都可能导致不能稳定获得高比例的存活心肌细胞[19,24]。加之高比例的存活心肌细胞多是在分离即刻，复钙后一旦位于生理浓度的细胞外Ca2+ 环境中，很容易诱发内质网中的Ca2+ 释放，使得胞浆内Ca2+ 的浓度迅速升高，抑制了心肌舒张过程中必需的Ca2+ 和肌钙蛋白的解离，从而导致心肌细胞的挛缩和死亡，产生“钙反常”(calcium paradox) 现象[24-25]，心肌细胞的存活比例将大幅降低；二是分离后的心肌细胞培养起来难度较大, 必须保证分离过程中的无菌环境和培养过程中的合适条件[26]。针对上述各影响因素，本实验主要在以下方面做了相应的改进：
①灌流装置的改进：经典的Langendorff离体心脏灌流系统包含数个蛇形管、玻璃容器和连接管道，主要依靠重力进行灌流，其高度通常在1m左右，不能放进普通的超净台内实现无菌操作，因此仅适合于电生理研究所需的单个细胞的急性分离。本装置经过改进和优化后，仅使用一个蛇形管和玻璃容器，连接软管的数量和长度也经过精简，大大降低了整个系统的高度，可置于超净台内完成整个灌流。此外，所有的液体均从位于下部的容器内加入，通过恒流泵恒流直接泵至蛇形管内，无需按照常规方法从位于上部的容器内加液体，再通过恒流泵双向调节以维持流入和流出液体的平衡。这样改进后还有另外两大好处，一是便于排空气泡，二是总容积也得以大大降低，在不影响分离效果的前提下有助于节约昂贵的胶原酶和蛋白酶的用量，每次酶液的总体积为40 ml，胶原酶和蛋白酶的用量分别仅为24 mg和1.2 mg。
②灌流液的选择与配制：目前对于解离细胞间结缔组织从而发挥主要消化作用的胶原酶的选择主要有Sigma公司的1型胶原酶和Worthington公司的2型胶原酶，我们经过比较最终选择了使用更为广泛的2型胶原酶。由于不同批号和批次的酶之间的差异性较大[27]，因此推荐首先试用几个不同批号的酶，然后择优集中购买一个批次，以保证实验的稳定性。本研究选用的批号为S8H10609（活性为330 u/mg），与文献报道的299 u/mg相近[27]。虽然有报道认为蛋白酶对细胞有一定的损伤[28]，但我们认为联合较低浓度的蛋白酶（0.003％，w/v）比单用胶原酶分离效果更好，细胞产量更高。胶原酶的激活需要微量Ca2+ 的存在（20～200 μmol/L），过量的Ca2+ 则会影响胶原酶的效果[29]。本实验发现50 μmol/L的效果最好。此外，水质也是一个容易忽视的问题，本研究先后采用了普通双蒸水和Millipore公司的超纯水，结果发现好的水质不仅直接影响分离即刻的存活心肌比例，而且也有利于维持复钙后心肌细胞的钙耐受性。酶解后的心肌细胞加入2％的牛血清白蛋白于37℃温育有利于结合毒性物质，维持细胞膜的完整，减轻酶对细胞的损伤[30]。有关灌流液的pH值，一般文献报道是调至7.4，本实验中调至7.25，略微偏酸，主要是为了配合100％O2 饱和气体而非一般使用的95％O2＋5％CO2混合气体（用以调节pH值），简化实验准备过程，实际应用效果不错。
③心脏状态的判断：酶消化的终止时间对分离效果的影响很大，消化时间过长可造成细胞不可逆的损害[31]。根据我们的观察，心脏从开始逆行灌注到消化完全其外观应该经历如下动态变化：在酶解之前呈红褐色，质较软；酶解过程中体积增大，逐渐变硬并开始发白；酶解完全后肿大、发白并塌陷，此时应及时终止酶解，开始温育。此外，适时在镜下观察外膜心肌细胞的形态也有助于判断酶解效果。
④梯度复钙的浓度与方法：国内文献报道梯度复钙多用四步法[21,32]，本实验简化为三步，其梯度依次为200，500 μmol/L和1 mmol/L。这样既简化了实验步骤，又不会导致复钙梯度过抖，有助于减轻“钙反常”，提高存活心肌的比例。
结论：实验结果表明，经过改良的Langendorff逆行主动脉灌流酶解法分离成年大鼠心肌细胞，可稳定获得高比例的存活心肌细胞并用于原代培养和细胞/分子生物学研究。
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