细胞凋亡又称程序性细胞死亡（PCD）,是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面，而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物的治疗等方面具有十分重要的作用。
细胞凋亡是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程没事一种生理性调节机制，与细胞坏死的死亡机制是完全不同，与细胞凋亡相关的癌基因和抑癌基因有两类，一类是促进凋亡的，如C-myc、野生型p53、Fas和Fasl、bcl-xs、ICE、bak、bad等；另一类是抗细胞凋亡的，如突变型p53、bcl家庭的bcl-2、bcl-XT及病毒来源的BHRF1等，这两类基因与调控细胞凋亡密切相关。在肿瘤研究中，如果促凋亡基因活化和高表达，将会导致肿瘤的发生和恶化，用药后受抑，表明药物疗效好，预后佳，肿瘤发生与发展受抑制。反之，若促凋亡基因受抑，肿瘤则发生和发展。如果抗凋亡的基因活化和高表达将促进肿瘤的发生与发展，会导致肿瘤细胞耐药、预后不良；反之则肿瘤的发生与发展受抑，对放疗、化疗敏感，疗效好。由此可见，研究细胞凋亡不仅对研究组织和细胞的分化有理论价值，而且对肿瘤的发生和发展及临床治疗均有指导意义。
一、细胞凋亡的特征
细胞凋亡的特征是内源性核酸内切酶的激活，染色质DNA被有规律的切成整数倍的核小体片断，凝胶电泳呈梯形图像，电镜下可见有形态学变化，如细胞皱缩、胞膜完整，胞浆致密，染色质浓缩成新月形并断裂，有核膜包绕含核碎片的凋亡小体形成。经4，6-二脒基二苯基吲哚（DAPI）荧光染色，可见有细胞固缩，核断裂后形成大小不等的块状或颗粒状的荧光碎片。由于核断裂后形成小片断可透过膜而丢失，仅剩下大片断在流式细胞仪检测细胞周时可测出，称“G1”期的AP峰（即凋亡峰）。
二、细胞凋亡的分子机制
细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，机体内多种因素可影响细胞凋亡的发生，如钙离子、镁离子、糖皮质激素能促进细胞内源性核酸内切酶活性，促进细胞凋亡，而锌离子能显著抑制钙离子和糖皮质激素这种诱导凋亡的作用，钙离子通道激活剂A23187可诱导细胞凋亡，但又可被内切酶阻断剂玫红三羧酸阻断。此外，类固醇、细胞毒性物质、秋水仙碱均能诱导细胞凋亡。
1、诱导细胞凋亡的因素或因子
诱导细胞发生凋亡的因素或因子很多，有些具有普遍性作用，如各种因素（射线辐射、热休克和紫外线照射等）导致DNA损伤，可诱导多种细胞发生凋亡。有些则具有一定的组织特异性，如糖皮质激素对淋巴细胞，转化生长因子-β1（TGF-β1）D对肝细胞的凋亡诱导作用。在胸腺细胞孵育的一个时期，T细胞抗原受体的诱导作用可导致胸腺细胞发生凋亡。在某些靶细胞中，肿瘤坏死因子（TNF）可诱导其发生凋亡，这些靶细胞便面具有TNF受体，其TNF受体与Fas同源。许多抗肿瘤药物可诱导肿瘤细胞发生凋亡，如多柔比星和道诺霉素、顺铂、长春新碱和秋水仙素等。
2、细胞生长因子去除后的细胞凋亡
越来越多的研究表明，最初被作为细胞增殖因子的多态生长因子中，有一些是细胞的存活因子，具有抑制细胞死亡，减少正常细胞丢失的功能，为多种类型细胞的存货所必需。几乎可以说，所有哺乳类动物细胞都要依赖于一种以上的生长因子来维持其存货，这些细胞生长因子对其靶细胞的细胞凋亡抑制作用并非特异，可被各种生长因子所替代。
去除生长因子诱发凋亡反应的机制，目前尚未完全弄清楚。不过，一些研究者提出，生长因子去除后，靶细胞受体获得的信号减少，引起信号传代途径的削弱，进而引发细胞许多基本功能的下调。例如，代谢速率减慢后，基因表达模式也会因此而发生改变。
Evan等人的实验表明，生长因子去除后基因的“不平衡“表达，对这些细胞的凋亡起关键作用。例如，IL-3依赖的祖细胞，去除IL-3后，细胞C-myc基因表达过度，加速了凋亡的发生。
（1）生理性激活剂：
TNF家族；Fas配体；TNF。
转化生长因子-β。
神经递质；谷氨酸；多巴胺；去甲基-D-天冬氨酸。
生长因子缺乏。
基质的丢失；附着体。
钙。
糖皮质激素。
（2）损伤相关诱导剂：
热休克。
病毒感染。
细菌毒素。
癌基因myc，rel，E1A。
肿瘤抑制因子p53.
细胞溶解性T细胞。
自由基。
抗氧化剂。
营养缺乏；抗代谢物。
（3）治疗相关因素：
化疗药物。顺铂；阿糖胞苷；长春新碱；甲氨蝶呤；多柔比星；争光霉素；氨芥。
γ射线。
紫外线
（4）毒素
乙醇。
β淀粉样。
3、细胞凋亡的抑制
对细胞凋亡具有抑制作用的因素主要有以下几个方面。某些癌基因或细胞凋亡相关基因具有抑制细胞凋亡的作用，如bcl-2、bcl-Xl（大分子蛋白）和突变型p53等。某些病毒感染靶细胞后，为延长其宿主细胞的寿命，以利其自身的修复，则移植宿主细胞发生凋亡。如EB病毒在宿主细胞中诱导bcl-2表达，并编码bcl-2基因 产物的同类物；腺病毒的E1B19000蛋白具有抑制细胞凋亡的作用。某些生长因子，如集落刺激因子（CSF）和神经生长因子（NGF）以及白细胞介素类(IL)具有抑制细胞凋亡的作用。正常的造血细胞因子，如粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-3和IL-6对细胞毒抗癌药或TGF-β1所介导的细胞凋亡具有抑制作用，IL-6对野生型p53介导的细胞凋亡具有抑制作用，IL-4对用氢化可的松的介导的慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡具有抑制作用。研究发现，在某些细胞凋亡发生过程中，存在大分子蛋白质的主动合成，某些药物如放线菌酮和放线菌素D，可通过抑制RNA和蛋白质的合成，抑制某些因素诱导的细胞凋亡。已报道的抑制凋亡物质如下。
（1）生理抑制剂：
生长因子
细胞外基质
CD40配体
中性氨基酸
锌
雌激素
雄激素
（2）病毒基因：
腺病毒E1B
杆状病毒p35
牛痘病毒CrmA
杆状病毒IAP
EB病毒BHRFI、LMA-1
非洲猪热病毒LMW5-HL
疱疹病毒34.5
（3）药理学因素
钙蛋白酶抑制剂
半胱氨酸蛋白酶抑制剂
肿瘤启动剂。PMA；苯巴比妥；α-六氯环乙烷。
易生物试剂库：https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
4、细胞凋亡相关基因及其调节
许多研究资料表明，细胞凋亡的激发与抑制是受遗传因素影响的，有多种基因参与细胞凋亡的基因调控，其详细的机制目前尚不清楚。
多种对细胞凋亡具有诱导或抑制作用的基因，其中一部分是癌基因，一部分是应用减数杂交等方法从凋亡细胞中分离的特异性细胞凋亡相关基因。
(1)诱导基因:
野生型p53
去调节C-myc
c-rel
E1A-PBX1
腺病毒E1A
华美新小杆线虫ced-3、ced-4
APO-1Fas、CD3
TRPM-2
未成熟胸腺细胞凋亡相关基因。RP-2、RP-8
（2）抑制基因:
Bcl-2
PML-RARs
V-raf
C-fes
V-abl
H-ras
突变型p53
EB病毒LMP1
腺病毒ElL19、E314.7
单纯疱疹病毒γ34.5
杆状病毒p35
华美新小杆线虫ced-9
三、 细胞凋亡的医学意义
1、凋亡在发生学的作用
2、凋亡与疾病
四、细胞凋亡试验常用的方法
（一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法：
用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。
次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。
培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。
用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率
抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值） x 100%。
（二）荧光法：
选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。
弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。
（三） DNA琼脂糖凝胶电泳法：
1、DNA提取：
用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。
分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。
于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。
冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。
上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。
吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。
加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。
加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。
2、琼脂糖凝胶电泳：
TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。
待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。
取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。
60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带，
（四）透射电镜形态学观察法：
收集药物作用后最佳凋亡时期的凋亡肿瘤细胞，细胞总量大于10^6个，用PBS洗2遍后用3%戊二醛固定1h，PBS洗2次，再用1%锇酸固定1h，丙酮酸梯度脱水。
细胞用树脂包埋，并进行超薄切片，用醋酸钠-枸橼酸铅染色，透射电镜下观察凋亡的细胞形态，可见有染色质浓集，不均匀分布，考核周边形成有核膜包裹的断裂核碎片，呈新月形凋亡小体，并选择典型切片图像摄影。
（五）流式细胞仪检测法：
1、原理：
处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相其DNA含量分布在2n-4n之间，发生凋亡的细胞内与核内DNA裂解成许多小片断，用细胞膜通透法可使小分子量的DNA片断穿过薄膜而丢失，仅剩下大分子量DNA片断，这些失去部分DNA的细胞可形成一个DNA含量小于2n的分布区，称“亚G1峰”，即AO峰（凋亡峰）。
2、特点：
经济简便，仅需单一染色。
可判断凋亡细胞发生于哪一周期。
可定量测定凋亡率，结果客观可信。
用同样本可同时进行“亚G1峰”测定及DNA凝胶电泳。
3、方法步骤：
收货不同剂量药物作用于各不同时期的肿瘤细胞，细胞总数应大于10^6个，用PBS洗2次，加入70%酒精固定，4℃存放。
染色前用PBS离心沉淀去除固定液，并用PBS洗1-2次，加入200ulRNA酶，37℃水浴30min。
每毫升细胞悬液中加入碘化丙锭（PI）染液100ul混匀，置4℃避光30min，用流式细胞仪进行细胞周期分析，低于G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。测定“亚G1峰”值和细胞凋亡率。
除上述常用的方法外，还可采用：
ELISA法。其凋亡的断裂核可与抗组蛋白抗体及抗DNA抗体混合物反应后形成双抗体“夹心”结构，再经酶显色也可判断。
末端转移的酶标记技术，利用核裂解碎片含有3/-OH的末端，在末端转移酶作用下加入已标记的核苷酸，在3/-OH末端上合成一段含标记的尾巴，再经酶显色或用荧光抗体显示出来。
五、bcl-2凋亡基因表达的检测
（一）原理：
细胞凋亡是一个受基因调控的主动过程，bcl-2是抑制细胞凋亡的原癌基因，正常细胞的激活和发育过程中都有表达，但在发育成熟的细胞中，其表达降低，在低分化或癌变的细胞中，bcl-2高表达与肿瘤的发生、发展相关，bcl-2过量表达常导致对化疗药物的耐药性而阻止细胞凋亡，影响治疗效果，一旦细胞发生凋亡，其bcl-2表达降低，甚至完全消失。
bcl-2家族由bcl-2、bcl-X、bax、mcl-1和A1组成。进行bcl-2基因表达的检测有两种，一种是用抗bcl-2蛋白抗体的流式细胞仪测定法，检测细胞浆中的bcl-2蛋白量，另一种是采用RT-PCR法测细胞中bcl-2 mRNA的表达。
（二）方法：
1、bcl-2蛋白表达的检测：
采用流式细胞仪和间接免疫荧光法测定细胞中bcl-2蛋白的量。
收集药物不同剂量、不同作用时间的凋亡肿瘤细胞，用含2%小牛血清的PBS洗2次。
加入2%多聚甲醛室温固定20min，再用PBS配制的Staing缓冲液洗涤。
1500r/min离心5min，弃上清，置-20℃存放过夜。
在冻存的细胞内加入1mlPBS配制的TB穿透液放置5min，用Staing缓冲液洗涤1次后，加2%灭活的人AB型血清1ml，37℃放10min。
加入bcl-2多抗工作液40ul，4℃孵育30min后，对照组不加多抗，随后用PBS洗3次，5min 1次。
加入FITC荧光标记的二抗工作液40ml4℃孵育30min后，用PBS洗3次，用流式细胞仪检测荧光强度（MFI）的变化，计算bcl-2阳性细胞表达率和bcl-2蛋白表达的平均荧光强度。
2、RT-PCR法检测细胞bcl-2 mRNA的表达：
（1）总RNA提取：
为了获得高质量的真核细胞mRNA，必须使用RNA酶抑制剂。操作过程中应避免RNA酶污染器材和试剂，因此所有剥离、塑料器材先用0.1%DEPC水溶液浸泡12h，然后用无菌的新鲜蒸馏水淋洗数次，塑料器材应采用高压蒸汽灭菌。玻璃器材应于180℃干烤4-6h，所有溶液配制用水均用已灭菌的新鲜蒸馏水配制，所用试剂要新开封的试剂，或无菌分装至已处理的容器中，操作时应戴60Co辐照的一次性手套，并勤换，以避免环境中和操作时的RNA酶污染。提取总RNA，采用异硫氰酸胍一步提取法即可。
收集药物处理和对照组的肿瘤细胞，用PBS洗2次，冷藏5min。
加入变性液Solution D 1ml。
用4号针头抽打混匀，再加入0.1ml的3mol/L乙酸钠充分混匀，加80%饱和酚1ml，氯仿/异戊醇0.2ml，混匀后置冰上15min。
于4℃、12000r/min离心5min，取上清移入另一洁净的塑料离心管中，加2.5倍体积的无水乙醇于-20℃过夜。
次日以4℃、12000r/min离心30min，弃上清，用70%预冷乙醇洗2次，干燥10min，加100ulDEP 水溶解RNA，再加入300ul变性液Solution D混合，再加2.5倍乙醇，-20℃放2h。
用70%预冷乙醇洗2次，加 EDPC水溶解，紫外分光光度计测OD260值、OD280值。当OD260/OD280在1.8-2之间时，RNA纯度较好。
（2）RT-PCR：
合成cDNA第一链。
各组取5ugRNA进行逆转录，反应体系共20ul：
a、5X逆转录缓冲液5ul；
b、DTT 1ul；
c、dNTP 2ul；
d、Rnasin 1.5ul；
e、Oligo dT 2ul
f、m-MLV 逆转录酶 2ul；
g、RNA样本 5ug
h、DEPC水补充加至20ul。
上述组分充分混合后，现在室温作用10min，后在42℃反应1h，经95深深地10min，立即置冰浴冷却至4℃，逆转录产物即cDNA第一链于-20℃冻存备用。
PCR反应扩增cDNA
a、P1上链，5/-GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG-3/;
b、P2下链，5/-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3/.
外参照物β-actin的引物序列如下：
a、P3链，5/-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3
b、P4链，5/-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3/
扩增的产物长度分别为459bp，339bp。
以逆转录产物为模板分别与bcl-2引物，β-actin引物混合，反应体系共有50ul；
a、双蒸水32.5ul；
b、10 x 缓冲液5ul；
c、MgCl2 5ul；
d、dNTP 1ul；
e、P1/P3 0.5ul；
f、P2/P4 0.5ul；
g、TaqDNA 多聚酶0.5ul；
h、cDNA样品9逆转录产物）5ul。
扩增条件：94℃预变性7min，设计PCR循环程序，94℃变性60s，55℃复性50s，72℃延伸60s，共30个循环周期，然后72℃延伸5min，4℃保存备用，并供凝胶电泳。
每组取PCR扩增产物8ul在TBE缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳（2%）。电压80V，电泳40min，紫外透射仪下观察电泳条带，其荧光带亮度可随凋亡的程度而有变化，证明bcl-2基因表达与不同剂量化疗药物作用时间有关，bcl-2基因表达与细胞凋亡呈剂量、时间依赖性。
六、JAM检测技术
JAM检测技术是用于测定细胞死亡或凋亡的方法，如51Cr稀放法事基于细胞死亡往往伴随有细胞膜破裂及细胞质的释放，用51Cr或125I标记相关的靶细胞，与效应细胞共培养一定时间后，测定一定体积的培养上清中的放射性计数，以反映细胞损伤情况。而人们发现，细胞死亡的早期反应，细胞内DNA被酶裂解成180kb左右的小片段，这一变化发生在细胞膜破裂之前，因而在由CTL介导的细胞死亡早期，靶细胞首先表现为出现DNA碎片。检测出靶细胞的DNA碎片，对于CTL介导的细胞死亡应是一个更为灵敏、准确的方法。Duke等人曾用差异离心的方法进行检测，但这一方法比较费时，不适合应用于较大样品量的常规检测。而Matzinger发现，可以用3H-TdR标记检测细胞增殖的方法加以改进来检测。
（一）检测原理：
用真空抽吸玻璃纤维滤纸上被3H-TdR标记的靶细胞，以测定靶细胞DNA断裂及细胞死亡。由于DNA被抽吸的过程中，DNA碎片可以通过抽吸穿过滤膜，因此只有来自于活细胞的完整的DNA被留在滤膜上，通过测定其cpm读数，即可了解细胞DNA被损伤的程度以及细胞死亡情况。
（二）实验方法：
1、靶细胞的培养及标记：
靶细胞（通常为肿瘤细胞如P815），通常在培养瓶中，用适宜的培养基，37℃、5% CO2条件下培养，实验前1天将其按（2.5-5）×105个/ml的浓度接种至24孔板中，培养1天后，向培养基中加入3H-TdR进行标记，使终浓度为2.5-5uCi/ml，不要搅动细胞，在37℃、5% CO2条件下继续培养一定时间，直至使用前。对于生长较快的靶细胞，培养4-6h即可标记，一般则培养过夜。
2、效应细胞的培养：
常规分离获得的C57BL/6大鼠脾细胞，按4×106个/空接种于24孔板中，以300Gy照射过的BALB/C大鼠脾细胞作为刺激细胞，培养5天后，于测试前将细胞收集按一定细胞数重新接种于96孔板中，100ul/孔，并进行一定稀释以达不同的效/靶比（R/T），每组至少设3个平行孔。
3、效应细胞、靶细胞作用：
靶细胞标记结束后，轻轻地将细胞吸出，洗涤1次，再按1×105个/ml浓度重悬，向已含有效应细胞的96孔板中加入100ul/孔的靶细胞，在37℃、5% CO2条件下共同孵育1-4h。
4、收获：
培养结束后，可用目前收集细胞用的细胞收集器将细胞及其培养基抽吸到玻璃纤维滤膜上，依次用双蒸水。三氯醋酸、无水乙醇洗涤及固定滤膜，烘干后，加入闪烁液，用液闪计算仪进行测定。
5、计算特异性杀伤率（%）：
特异性DNA杀伤率（%）=[（S-E）/S]×100%
