一、实验目的
1 掌握诱导细胞凋亡和观察细胞凋亡小体的方法
2 掌握DNA电泳检测方法，证明凋亡细胞DNA Ladder的存在。
细胞死亡作为生物体的一种常见现象，一般可分为两种类型：细胞坏死（necrosis）和细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。后者也称细胞凋亡（apoptosis）。细胞坏死是细胞在遭受极度刺激时引起的细胞死亡，以细胞质膜的破裂为特征，造成内含物的炎性泄露，是一种非正常死亡。细胞凋亡是细胞的一种“主动性”死亡行为，由基因控制，表现为细胞染色质凝集并边缘化、细胞浓缩、凋亡小体产生及DNA片段化等。由于片段化而形成的DNA Ladder被认为是细胞凋亡的典型特征。
细胞程序性死亡被分为两类：受体介导的细胞程序性死亡和线粒体介导的细胞程序性死亡。本实验主要涉及到线粒体介导的凋亡途径。线粒体可以进行氧化磷酸化并产生ATP，同时它还可以诱导产生PCD发生的物质-细胞色素C（cyt C）的泄漏。线粒体膜上存在 Bax组成的孔道。Bcl-2等抑制它的开放，从而抑制PCD因子的释放和阻止PCD的发生。而Bad 等促进Bax开放，从而导致Apaf: apoptosis protease activating factor 活化，使cyt C的释放，促进Cyt C,Apaf-1, caspase-9复合物的形成，使得细胞处于细胞凋亡的执行阶段（见图10-7）。凋亡的标准特征之一，是基因组DNA断裂为180-200bp的多条寡核小体片段。此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。DNA梯状序列最后可在紫外灯下显示，人们可以照像记录它的电泳行为。根据DNA的电泳行为，人们就可以判断出细胞死亡的类型。凋亡细胞形成明显的梯状DNA，坏死细胞为不清晰弥散状DNA，而活细胞DNA在琼脂糖凝胶的顶部，是一个没有受到切割的高分子量条带。
二、实验原理
Cyt c是电子传递链的重要组成部分，定位于线粒体内，是真核细胞内不可缺少的重要因子。但当他溢出线粒体后就会诱导细胞凋亡。在本实验中，对洋葱内表皮、烟草悬浮细胞或人口腔内皮细胞等加入Cyt c或其他诱导物，观察诱发产生的凋亡细胞。用改良苯酚品红染色观察凋亡细胞核发生染色质凝集（condensation）、趋边化(margination)、DNA裂解（fragmentation） 产生凋亡小体等形态学上的变化，用琼脂糖凝胶DNA电泳检测细胞凋亡后形成的DNA Ladder。
三、材料、试剂和仪器
1． 材料 采用的烟草悬浮细胞株系、洋葱内表皮和人口腔内皮细胞。
2． 试剂的配制：
1）烟草悬浮细胞的基本培养基
2）100 μmol/l Cyt c 的水溶液
3) 170 nmol/L 或230 nmol/L 的CaCl2
4）改良苯酚品红染色 先配母液A和B。
母液A称取3g碱性品红，溶于100mL的70%酒精中（此液可长期保存）。
母液B:取母液A 10mL，加入90mL的5%石碳酸水溶液（2周内使用）。
苯酚品红染色液：取母液B 45mL，加入6mL冰乙酸和6mL 37%的甲醛。
改良苯酚品红染色：苯酚品红染色液2-10mL，加入90-98mL 45%的醋酸和1.8g山梨醇。
此染液初配好时，颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。
5） 1% 的琼脂糖凝胶
6） 2ⅹCTAB buffer：2％（w/v）CTAB、100mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、1％ PVP、
7) 氯仿:异戊醇(24：1)
四、实验程序
1． 取样
1）直接撕取洋葱内表皮和刮取人口腔上皮细胞
2）烟草悬浮细胞的培养 烟草(Nicotiana tabacum)悬浮细胞在改良的MS液体培养基（内含MS基本培养基, KH2PO4 200 mg/L，2，4-D 1 ml/L，Gly 1.8 mg/L，VB1 0.6 mg/L）中继代培养，每7天继代一次，培养基pH 5.8，110 rpm/min摇床振荡，25℃悬浮培养。
2．细胞凋亡的诱导
1）Cyt c处理：共做三组样品。试验组样品要先经Cyt c处理，浓度为12.5 μmol/L，如实验材料为人口腔上皮细胞，时间为1hr左右，如是洋葱内表皮或烟草悬浮细胞时，时间控制为48hr左右；正对照样品不需处理，为正常生长的细胞；负对照样品是将正常的细胞煮沸30min，使其坏死。在具体做实验时，也可以采用不同浓度的Cyt c进行处理：
（1） Cyt c诱导人口腔上皮细胞的凋亡步骤：
①涂片；
② 漂洗均参照细胞骨架实验的操作；
③处理：浸泡于三种不同浓度的Cyt C溶液中；
④分别于1hr后分时间段取出，用改良苯酚染液染色30min；
⑤镜检观察。
（2）细胞色素C诱导的洋葱内表皮细胞凋亡步骤：
①将洋葱内表皮切成1cm2的小块，浸泡于三种不同浓度的Cyt C溶液中；
② 48hr后用改良苯酚染液染色30min，洗去表面染料，放在载玻片并压片；
③镜检。
2） 高浓度Ca2+的处理：170 nmol/L或230 nmol/L 的CaCl2处理材料1hr左右，样品操作方法同上。
3． 形态学观察
在显微镜下观察细胞形态并对试验组细胞进行凋亡率统计。随机选取5个视野，统计总细胞数和凋亡细胞数（以细胞核染色质出现明显的边缘化凝集为标志），计算凋亡率（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。最后在普通光镜下照相。
4． 基因组DNA的提取
对以上三组不同处理的样品分别进行基因组DNA的提取（方法参见第一章，实验2），并进行1% 琼脂糖凝胶电泳的检测。
五、 结果与分析
1． 形态学变化
烟草悬浮细胞系BY-2的对照组细胞胞质透明，核圆形且周围有许多颗粒状物质分布，细胞多聚集成团（见图8-2 A，C）。实验组BY-2经12.5μmol/L Cyt c处理48hr后，显微镜下均可见细胞染色质明显聚集在核膜边缘、形成凋亡小体，细胞胞质内均匀分布着碎末状物质，细胞分散均匀，不成团状（见图8-2 B,D）。在光镜下可以观察到高钙诱导的细胞凋亡现象为，细胞核内染色体出现明显的聚集现象。
2． 琼脂糖凝胶电泳结果
经细胞凋亡诱导的细胞，分别提取总DNA。然后经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外投射仪上观察。经 Cyt c处理不同时间细胞的DNA出现了不同断裂程度的DNA Ladder。
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