一、实验目的
学习用母液法配制MS培养基以及掌握培养基灭菌的方法及操作过程。
二、实验原理
对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功至关重要的。另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控，次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。
三、实验器材和药品
器材：天平、烧杯（1000ml）、医用瓷缸（1000 ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。
药品：蔗糖、琼脂、1mol/L NaOH、HCl、各种培养基母液。
四、实验步骤
（一）培养基的配制（以1L MS培养基为例）
1、计量
根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000ml/ 母液浓度（mg/L）。
2、移液
按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。
注意：
①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。
②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。
③移液管不能混用。
3、称取
称取8g琼脂，30g蔗糖备用
4、融化
用搪瓷量杯量取600～700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。
注意：在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。
5、混合
将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。
6、调pH
用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH 达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.2～0.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.2～0.5个单位左右)。
注意：调至时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。
7、分装
溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 ml或100 ml)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1L培养基，可分装25～30瓶。
8、包扎
用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。
注意：培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基pH值降低，从而使琼脂凝固力下降，发生培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固现象。避免此现象发生的方法是:调整培养基pH值，一般不低于5.6，若需酸性较强培养基，可适当增加琼脂用量。
（二）培养基的灭菌
培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。
1、高压蒸汽灭菌法
把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，进行高压灭菌。外培养基自然冷却凝固。放置1 d后再使用。
表1>> 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间
>
| 容器的体积(ml) | 在121℃下最少灭菌时间(min) |
| 20~50 | 15 |
| 75~150 | 20 |
| 250~500 | 25 |
| 1000 | 30 |
| 1500 | 35 |
| 2000 | 40 |
注意：（1）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在事实上达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守灭菌时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果。对蒸馏水，各种器具灭菌时，灭菌时间要适当延长，压力也要提高，一般在126℃维持一个小时。另外三角瓶中的液体不超过总体积的70%，否则当温度超过100℃时，培养基会喷溢，造成培养瓶壁和封口膜的污染。
（2）消毒后的培养基不能立即用于接种，而应放置24-72h。放置后如果培养基中没有出现菌落，则说明培养基是无菌的，才可以用于接种。另外做好的培养基一般应在1-2周内用完，短时间可存放于室温条件，如不能尽快用完，应放在4℃条件下。
表2 饱和蒸汽压力与其对应的温度
>
|
饱和蒸汽压力 > kg/cm2>> 磅/平方英寸 |
温度 > ℃ |
饱和蒸汽压力 > kg/cm2>>> 磅/平方英寸 |
温度 > ℃ |
||
| 0.0 | 0 | 100 | 1.055 | 15 | 121.0 |
| 0.141 | 2 | 103.6 | 1.125 | 16 | 122.0 |
| 0.281 | 4 | 106.9 | 1.266 | 18 | 124.1 |
| 0.442 | 6 | 109.8 | 1.406 | 20 | 126.0 |
| 0.563 | 8 | 112.6 | 1.543 | 22 | 127.8 |
| 0.703 | 10 | 115.2 | 1.681 | 24 | 129.6 |
| 0.844 | 12 | 117.6 | > | 30 | 134.5 |
| 0.984 | 14 | 119.9 | > | 50 | 147.6 |
2、过滤除菌
培养基中某些成分是热不稳定的，在高温湿热灭菌中可能会降解。这类物质需要进行过滤灭菌。例如一些生长因子，如赤霉素(GA)、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至40℃,再将过滤灭菌后的该化合物按计划用量依次加入,摇匀,凝固后即可使用。如果是液体培养基，没有凝固这个问题，则可在冷却到室温后再加入。
除菌滤膜其孔径尺寸一般要小于或等于0.4μm。过滤灭菌的原理，是溶液通过滤膜时，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。滤膜的吸附作用力也不容忽视，往往小于滤膜孔径的细菌等亦不能透过。在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置。液量少时可用注射过滤器，它由注射器、滤器(可更换)、持着部分和针管等几部分组成。注射器不必先经高压灭菌，而后面几部分要预先用铝箔或牛皮纸等包扎好，最好放在有螺旋盖的玻璃罐中，经高压灭菌，滤器灭菌不应超过121℃。由于这个“注射过滤灭菌器”小巧、方便、实用，在液量多时多用几套这种装置(亦可适当重复使用)也能顺利完成液体灭菌操作。在使用前按无菌操作要求将注射过滤灭菌器的几个部分装配在一起，把吸有需要过滤灭菌溶液的注射器插入细菌过滤器与之相配合的插接口，推压注射器活塞杆，将溶液压过滤膜，从针管部分滴出的溶液就是无菌溶液了，但是滤膜不能阻挡病毒粒子通过。在一般情况下，人工配制的溶液不会含有使植物致病的病毒。更严格的实验研究中，这一点仍不容忽视。毫无疑问，过滤过的溶液要按无菌操作要求尽快加入培养基中，以免重新遭到污染。假如需经过滤灭菌的溶液带有沉淀物，那么在过滤灭菌之前可用3号烧结玻璃滤器预先予以去除，这样可以减少细菌滤膜微孔被堵塞的情况。
