一 基本原理
免疫组织/细胞化学是利用抗原抗体具有高度特异性结合反应的原理，采用已知抗体检测组织或细胞的抗原物质，然后以适当的方式显示其结合信号以证明组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。
二 基本步骤
1 三步法：以SP（链霉卵白素-过氧化物酶）试剂盒为例：
石蜡切片脱蜡至水。
蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3% H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，5min×3次。
5-10% 正常山羊血清封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。
PBS冲洗，5min×3次。
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20min。
PBS冲洗，5min×3次。
滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10-30min；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10-20min。
PBS冲洗，5min×3次。
显色剂显色（DAB或AEC）。
自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片。
2 二步法: 以通用型二步法检测试剂盒为例。
石蜡切片脱蜡至水。
蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3% H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，5min×3次。
滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。
PBS冲洗，5min×3次。
滴加试剂1（polymer helper）,室温或37℃孵育20min，PBS或TBS冲洗，5min×3次。
滴加试剂2（poly pero×idase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵育20-30min，PBS或TBS冲洗，5min×3次。
显色剂显色（DAB或AEC）。
自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片。
3 冰冻切片的免疫组化染色步骤：
冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。
室温放置30min后，入4℃丙酮固定10min。
PBS冲洗，5min×3次。
用过氧化氢孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗，5min×3次。
以下同石蜡切片免疫组化染色步骤（滴加一抗开始）
三 对照试验设立：
免疫组化染色结果的判断的一个重要因素就是设立阴性和阳性对照片，只有这样才能排除各种因素的干扰而正确评价染色结果。
1 阳性对照：
选择与待测片靶抗原相同，且含中等量抗原，染色前处理过程相一致的切片。所有试剂标准化，染色方法具可靠性，一致性。当阳性片呈阳性结果时，即可初步确定待检片性质。
2 阴性对照：
排除染色过程中非特异染色和交叉反应所造成的假阳性结果。
（1） 空白对照：排除组织细胞自发荧光，或所含生物素，以及内源性酶等物质；
（2） 替代试验：可用待测抗原的特异性抗体的同一动物免疫前血清或同种动物非免疫血清，也可用与靶抗原无关的抗血清；以及用缓冲液（PBS）替代等。
（3） 吸收试验：可用过量已知抗原与抗体在4℃下充分反应，离心后进行免疫组化染色，已知阳性片呈阴性或弱阳性反应。
（4） 抑制试验：多应用间接法，第一步先加非标记抗体，待充分反应后再加同一标记抗体，另一张切片可用正常血清或缓冲液代替非标记抗体。结果前者阴性后者阳性。
四 结果分析
| 编号 | 阳性片 | 待检片 | 阴性对照 | 结论 |
| 1 | - | - | - | 操作错误，抗体失效 |
| 2 | + | + | + | 非特异性着色 |
| 3 | - | + | - | 阳性片不含靶抗原 |
| 4 | + | - | - | 待检片不含定位抗原 |
| 5 | + | + | - | 待检片含定位抗原 |
染色结果的判断除了上述之外，还可以从以下方面加以判断：
（1） 阳性反应与非特异性着色区别：阳性反应分布总是有规律性的，局限定位某一部位而非特异性着色则无规律性，无界限，定位不准确，且不能重复，结缔组织受染和内源性产物干扰是最多见的非特异性着色。
（2） 人为造成非特异性反应如切片折叠，刀痕，以及组织处理过程中出现的色素，沉淀物以及组织细胞坏死等都可以出现非特异性反应。
（3） 有的抗原被吞噬细胞吞噬，或停留某一部位，这些都影响抗原的正确定位。
（4） 如阳性对照和待检片都呈阴性反应，检查操作中是否颠倒了抗体顺序或漏加某一抗体；组织在处理中抗原被破坏；某一抗体失效；显色试剂如DAB配制时漏加H2O2等。
（5） 阳性和待测片均呈弱阳性，抗体稀释度过大；切片残留缓冲液过多；孵育时间过短，抗体放置过久效价下降等。
（6） 所有切片过度着色，多见于显色液中H2O2过多，显色过长，切片粘合剂使用不当，切片过厚，抗体稀释不够，或没有用非免疫血清处理切片等。
五 常用液体的配制：
10.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS） PH7.2
NaH2PO4 储备液（A） 19ml
NaHPO4 储备液（B） 81ml
Nacl 17g
加双蒸水至 2000ml
注：A液 0.02M NaH2PO4.2H2O 31.2g 加蒸馏水1000ml
B液 0.02M NaHPO4.2H2O71.6g加蒸馏水1000ml
20.05mol/L TBSPH7.6
0.2mol/LTris 250ml
0.1mol/L Hcl 400ml
Nacl 8.5g
蒸馏水加至 1000ml
2 0.05mol/L枸橼酸缓冲液 PH5.5-6.0
醋酸胺储备液 99.0ml
枸橼酸储备液 1.0ml
注：储备液配制： 醋酸胺1.93g 加蒸馏水500ml
枸橼酸1.05g 加蒸馏水100ml
3 3,3´--二氨基联苯胺（DAB）显色液
DAB 5mg
0.05mol/L PH 7.6 TBS 10ml
30% H2O2 µl5
将5mgDAB溶解于10ml0.05mol/L PH 7.6 TBS中，充分搅拌，使之溶解后，用双层滤纸过滤，用前加 30% H2O2 5µl。显色阳性结果为棕褐色。
4 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）显色液
AEC 4mg
二甲酰胺（DMF） 1ml
0.05mol/L PH5.2 醋酸缓冲液14ml
30% H2O2 µl15
先将AEC溶解于DMF中，再加入醋酸缓冲液，充分 混匀，用前加30% H2O2。显色阳性结果为红色。
5 3%过氧化氢（H2O2）
90ml的蒸馏水或甲醇中加入10ml的30% H2O2 即可。用于封闭内源性过氧化物酶。
6 0.4%胃蛋白酶（Pepsin）
胃蛋白酶400mg溶于100ml的0.1NHCL中即可。消化时间37℃、10-30min。主要用于细胞间质抗原的免疫组化。
7 0.1%胰蛋白酶（Trypsine）
胰蛋白酶 0.1g
0.1%氯化钙100ml
浓Hcl 7ml
首先配制0.1%的CaCl2, 用0.01mol/L的NaOH将其PH值调至7.8，然后加入胰蛋白酶溶解，必要时可过滤。消化时间37℃、5-30min。主要用于细胞内抗原的暴露。
