[目的与原理]
掌握一种聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的方法，并用此法进一步分析血清蛋白的组成。
1、聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）、NN′—甲叉双丙烯酰胺（Bis），在催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate (NH4)2S2O8 简称AP）或核黄素（ribofavin 即vitamin B2 ,C17H20O6N4）和加速剂N,N, N′,N′—四甲基乙二胺（N,N,, N′N′—ytetramethyl ethyenediamine，简称TEMEM）的作用下，聚合而成的三维网状结构。
a.目前常用的催化体系：
(1) Ap—TEMED：
① TEMED催化Ap生成硫酸自由基：
S2O82— →2SO4—
（过硫酸） （硫酸自由基）
②硫酸自由基的氧原子激活Acr单体，并形成单体长链：
③Bis 将单体长链间连成网状结构：
从反应式中可看出此凝胶是三维网状的，带不活泼的酰胺基侧链的聚合物，没有或很少带有离子侧链，因而凝胶性能稳定，无电渗作用。在碱性条件下，凝胶易聚合，其聚合的速度与Ap浓度平方根成正比。杂质、某些金属离子，低温和氧分子能延长或阻止碳链的延长与聚合作用。用此法聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶。
(1) 核黄素—TEMED： 这是光聚合作用。TEMED可加速凝胶的聚合，但不加也可聚合，光聚合作用通常需要痕量氧原子存在才能发生，核黄素在 TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量氧会阻止链长的增加，因此应避免过量氧的存在。
b. 凝胶的性质
(1) 机械性能与孔径
T＝（a+b）/m×100% T:凝胶总浓度，a：Acr克数，b：Bis克数，m，缓冲液体积（ml）
C=b/(a+b)×100% C：交联度
a/b(w/w)与凝胶的机械性密切相关。当a/b&10时凝胶脆而易碎，坚硬呈乳白色；a/b<100时，即使5％的凝胶也呈糊状，易断裂。预制备完全透明而又有弹性的凝胶应控制a/b＝30左右。不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，B.J.Davis的实验发现Acr&2％，Bis&0.5%,凝胶就不能聚合，当增加Acr浓度时要适当降低 Bis的浓度，通常T为2%—5％时，a/b＝20左右；T为5%—10％时，a/b＝40左右。T为15%—20％时，a/b＝125—200左右。在研究核酸大分子时，常用T=2.4%大孔凝胶，此时凝胶太软不易操作，最好加入0.5％琼脂糖，有的在3％凝胶中加入20％蔗糖，也可增加其机械强度而不影响其孔径的大小。一般来说，T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大；T浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。
（2）分子量范围与凝胶浓度关系如下表1-2-9
2、电泳原理
（1）浓缩效应
①凝胶孔径不连续；样品胶T＝2.5％为大孔胶，分离胶T＝7.5％为小孔胶。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢，所以在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
表1-2-9 分子量范围与凝胶浓度的关系
② 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性（电位梯度不连续性）样品胶和浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl,缓冲液，电极缓冲液为pH8.3的Tris- Gly。HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl—,而Gly的pI为5.97，所以Gly在样品胶和浓缩胶中解离度很小，仅有1%－0.1%。而有效迁移率＝mα（m为迁移率，α为解离度），所以Cl-的有效迁移率最快成为快离子，而Gly的有效迁移率最慢成为慢离子，在样品胶和浓缩胶中所选用的pH值必须使有效迁移率满足下述条件：
快离子<样品离子<慢离子。因此在快离子后边形成一个离子浓度低的区域，即：低电导区，又因为E＝I/η（E：电位梯度，η：电导率，I：电流）。低电导率将产生一个高电位梯度，因而在高电压梯度区和低电压梯度区之间，形成一个迅速移动的界面（如图1-2-11）。由于样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间，所以就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄膜。
图1-2-11不连续电泳浓缩效应示意图
（2） 分子筛效应：进入分离胶后，分离胶为pH为8.9的Tris—HCl 缓冲液Gly解离度增大，因而它的有效迁移率也增加，此时Gly很快就赶上并超过样品分子，这样高电压梯度就不存在了，使样品进入一个均一的电位梯度和pH条件的分离胶中。分离胶的孔径较小，分子量或形状不同的样品通过分离胶，所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率。
(3)电荷效应：进入分离胶后，样品除了具有分子筛效应外还根据带电荷不同，迁移率不同进行分离。
[试剂与器材]
试剂：
1、按下表配制贮液和工作液
2、0.1％溴酚蓝指示剂
3、染色液 用7％醋酸液配制成1％氨基黑10B染色液。
4、脱色液 7％醋酸溶液
材料：
人、鱼等动物血清。
器材：
常压电泳仪；圆盘电泳槽；玻璃管（内径约0.5 cm—0.7cm，长度约8 cm— 10cm）；有机玻璃架（或自制木头架）；微量进样（100μL）器；5ml注射器；长、短注射针头；长、短颈滴管；日光灯或100w白炽灯；乳胶管；玻璃球（或小段玻璃棒）；培养皿；烧杯；洗耳球。
[实验步骤]
一般先制分离胶，再在分离胶上面制作浓缩胶。将贮液提前由冰箱中取出，达到室温后，按上表的比例配制工作溶液。
1、分离胶的制备 先在一只烧杯按比例加入分离胶原液1号、2号贮液和蒸馏水，在另一只烧杯中加入3号贮液，将上述两烧杯均置于真空干燥器中，抽气约20分钟。取出后，立即将两烧杯溶液小心混匀（沿壁倒入溶液并在桌面上小心转动烧杯或用玻璃棒缓慢搅动使其混匀），注意避免溶液中产生气泡。用带长针头的注射器或长颈滴管吸取分离胶混合液，沿着管壁加到预先准备好的玻璃管中（玻璃管的一端用带有玻璃球的小段乳胶管塞紧，并加入2滴40％蔗糖液后插在有机玻璃架上）。灌入的分离胶混合液高约6.5cm，然后立即用注射器或滴管在距胶面约0.1cm处沿管壁缓缓加入蒸馏水层（切忌搅动胶面），水层约高0.5cm以隔绝空气，在室温下（冬天室温过低，可置25℃温箱中）静置使其聚合。刚加好水层时能看出界面，后逐渐消失。待再次看到界面时，表明凝胶已经聚合，一般约需10min—20min。再静置30min使其聚合完全。
2、浓缩胶的制备 用注射器或滴管吸去分离胶面上的水层，并用滤纸条吸去残留的水液（滤纸条不能接触胶面），在分离胶面上制作浓缩胶层。
接上表比例在一只烧杯中加入4、5、6和在另一只烧杯中加入7号贮液，将上述两烧杯均置于真空干燥器中，抽气约20min。取出后，立即将两烧杯溶液小心混匀（沿壁倒入溶液并在桌面上小心转动烧杯或用玻璃棒缓慢搅动使其混匀），注意避免溶液中产生气泡，立即在分离胶面上加入浓缩胶混合液约1cm高，并立即用水封，置日光电灯下进行光聚合反应。当看到浓缩胶呈现乳白色时，表明已经聚合，一般约需5min—10min。继续光照30min使其聚合完全。然后除去水层，用滤纸条吸干后，再加电极缓冲液至管顶备用。
3、装槽 凝胶管制备好后，先将下边的乳胶管除去。注意先拉开乳胶管使空气进入后，再拔下来以防止将凝胶拉环拉坏。再将每一根凝胶管固定在圆盘电泳槽上的橡皮塞孔上，应保持垂直，橡皮塞孔要密封不漏。使每个凝胶管的下端悬上一滴缓冲液，再把上槽放到已盛有电极缓冲液的下槽上（应避免管下有气泡，如出现气泡，可轻轻振荡，或用弯头滴管排出）。最后在上槽中加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液应没过凝胶管。
4、加样 3μl血清加入 0.15ml（4号贮液：蒸馏水：20％蔗糖溶液＝1︰3：4）混合液后并加入5μl 0.1％溴酚蓝指示剂混合，即为样品液。用微量进样器吸取 0.15 ml样品液，小心地加到玻璃管中浓缩胶与电极缓冲液的界面处。因样品液比重大，会平铺到凝胶表面上。
5、电泳 各管加样毕，将电泳槽与电泳仪连接好。上槽接负极，下槽接正极。打开电源开关，调节电流。开始电泳时1 mA/管—2mA/管。当样品液进入浓缩胶与电极缓冲液的界面处时，升高电流到3 mA /管—5 mA /管。待溴酚蓝指示剂移动到凝胶柱的下端约0.5cm处时，关闭电源开关，停止电泳，取出玻璃管。
电极缓冲液可回收使用，但上下槽缓冲液不能混淆，因下槽缓冲液已混入催化剂和Cl—等。
6、剥胶 用长针头注射器吸满水。一般将针头从浓缩胶一端插入凝胶条与玻璃管壁之间（注意紧贴管壁），一面沿管壁转动并推针前进，靠水的压力和润滑作用使玻璃管内壁与凝胶条分开。待水从玻璃管另一端流出时，再慢慢将针头退出。用洗耳球插入管口吹气，缓慢将凝胶条自玻璃管脱出。
7、固定与染色 剥出的凝胶条立即浸泡盛有染色液的培养皿中约10min，同时进行蛋白质区带固定和染色。染色液用毕回收可反复使用。
8、脱色 染色后的凝胶条先用自来水冲掉表面的多余染料，再用7％醋酸溶液浸泡脱色。经常更换醋酸液，直到凝胶条上没有染料脱下来，背景几乎无色为止。约需2d—3d。
9、绘图 脱色清楚后的凝胶条上出现一个个圆盘状的蛋白质区带，将分离结果绘图。
[方法评估]
1、在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。
2、化学性质稳定，与被分离物质不起化学反应。
3、对pH和温度变化较稳定。
4、几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。
5、凝胶孔径可调节，根据被分离的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。 6、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩，分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
[应用意义]
PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。
[注意事项]
1、贮液放冰箱中一般可保持1—2个月，但3号贮液只能保存一周。如有不溶物可过滤。
2、Acr和Bis 对神经系统有毒害，使用时要小心，注意勿与皮肤接触。但聚合后的凝胶对人体无害。
3、电泳时的电流最好不超过5mA/管，以免产生过多热量。室温高时应进行冷却或冷库内进行电泳。
4、本实验需时间较长。在一次实验中可安排到脱色一步，再于下一次实验中观察脱色后的胶条并绘图。
5、在碱性条件下，凝胶易聚合，其聚合速度与Ap浓度平方根成正比，一般在室温下，pH8.8时，7.5％丙烯酰胺溶液30min完成聚合作用，在pH4.3 时聚合速度很低，约需90min才能聚合，此外应选择高纯度的Acr和Bis。杂质。某些金属离子、低温和氧分子能延长或阻止碳链的延长与聚合作用。
