一、 目的及要求。
1、 了解质粒作为载体在基因工程中的作用
2、 熟记提取质粒的基本原理，学习提取过程和方法
3、 为下一步实验提供高纯度的 DNA 样品
二、原理：
1、质粒（Plasmid）：独立于染色体以外的双链、闭合、环状DNA，可自我复制。为基因工程中的常用载体（Vector）
2、作为载体的质粒需具备以下特点：
1） 能自主复制。
2） 具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，又称为多克隆位点（multiple cloning sites, MCS），便于外源基因的插入。
3） 具有 1 个以上的筛选标记（抗性基因）。
4） 分子量相对较小，多拷贝。
5） 非结合性质粒。
6） 转化效率高。
* 目前已有一系列符合上述要求的质粒作为商品供应。
3、大肠杆菌中提取纯化质粒的主要步骤：
1） 细菌的培养：LB 培养基+氨苄青霉素
O.D600=0.4 对数生长期 O.D600=0.6 对数生长后期
2）细菌的收集和裂解
收集：离心，STE 液洗 1-2 次，去除代谢物
裂解：SDS 法、碱裂解法、煮沸法
碱裂解法：EDTA 破坏细菌的细胞壁和细胞外膜→SDS 裂解细胞膜→NaOH 使核酸、蛋白质变性。
3）质粒的分离和纯化
加入酸液，质粒 DNA、小分子 RNA 复性（可溶），染色体 DNA、高分子量 RNA、K+/SDS/蛋白质/膜复合物沉淀，离心弃除；酚:氯仿抽提去除蛋白质；RNAse 去除残留小分子 RNA……。
三、试剂：略
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四、操作：
1． 将 0.2ml 含重组质粒 pIL 的大肠杆菌接种于 2.5ml LB 培养基（含 Amp 100ug/ml）中，37℃、150rpm 振荡培养过夜。
作用：加 Amp 的目的为使含 Amp 抗性基因的细菌选择性生长。
2． 取 1.5ml 菌液置于 1.5ml EP 管中，15,000rpm 离心 30 秒，弃上清，将培养液尽量控干。
作用：沉淀细菌。注意：控干时将吸水纸卷成圆柱状，沿管壁轻轻吸取水珠。控干时不要触及细菌沉淀。
3． 加入 1ml STE 溶液，漩涡振荡器上振荡悬菌，15,000rpm 离心 5min，弃上清，控干。
作用：去除培养基中残留的细菌代谢物。
4． 加入 100ul 溶液Ⅰ，震荡悬菌，室温放置 5min。
作用：Glucose--增加溶液粘度，保护 DNA；Tris-HCl--缓冲液；EDTA--螯合二价阳离子，抑制核酸酶，预处理细菌。注意：在漩涡振荡器上震荡悬菌
5． 加入 200ul 溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀 5 次，置冰浴 5min。
作用：SDS--去污剂，使细胞裂解；NaOH--变性剂，使蛋白质、核酸变性。注意：此时溶液呈胶胨状，严格控制混匀次数和变性时间。
6． 加入 150ul 溶液Ⅲ，颠倒混匀，置冰浴 10min。
作用：酸液，中和 NaOH，使质粒 DNA、小分子 RNA 复性（可溶），染色体 DNA、高分子量 RNA、K+/SDS/蛋白质/膜复合物不能复性而沉淀
注意：此时溶液出现大量絮状沉淀
7． 15,000rpm 离心 5min，将上清 400ul 转移至另一干净 EP 管中，弃沉淀。
注意：将枪头插入溶液中央吸取，不要将沉淀吸出，用吸水纸擦拭枪头。
8． 加入 240ul 异丙醇（0.6 体积），混匀，置室温 10min。
作用：沉淀核酸（DNA、大分子 rRNA、mRNA）和蛋白质。
9． 15,000rpm 离心 10min，弃上清，控干。
10． 50ul TE 溶解沉淀，加入 50ul 冰预冷的 5M LiCl，混匀，置冰浴 10min。
作用：使大分子大分子 rRNA、mRNA 沉淀，而 DNA 不沉淀。
11． 15,000rpm 离心 10min，上清 100ul 转移至另一 EP 管中。
12． 加 2 倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，-20℃沉淀 10min。
13． 15,000rpm 离心 10min，弃上清。
14． 待乙醇挥发后，将沉淀溶于 20ul TE。将质粒 DNA 溶液置于-20℃ 保存。
五、注意事项：
1． 严格控制碱变性的时间时间，不超过 5 分钟。因为，如质粒处于强碱性环境中时间过长，可发生不可逆变性，导致限制性内切酶切割困难。
2． 在加入溶液 III 后，要充分混匀并置冰上。如未见大量白色沉淀，说明实验失败，应立即重做。
3． 弃上清时，必须控干即除尽管内的液体，在做最后一步时，应尽量将乙醇挥发干净，因为如残留较多乙醇，以后在做酶切鉴定时，乙醇会使限制性内切酶失活。但此步的时间不宜过长，一般在 10-15 分钟左右，可用滤纸条小心吸净离心管壁上的乙醇液滴以节省时间。
