流式细胞术是血小板分析研究最好的方法,该法可提高检测灵敏度、并减少人为因素的干扰,该法可以精确地检测病人血小板生成方面的情况,即使血小板计数很低时也可检测表面标记。
血小板RNA 含量 (网织血小板)
血小板RNA 含量与血小板生成状态相关,他可以区分是因为骨髓抑制或外周破坏增加引起的血小板减少。在化疗后或移植后,网织血小板可以监测巨核细胞和血小板生成状态。
血小板相关免疫球蛋白(PA-IgG)
已经确认,血小板相关免疫球蛋白和ITP 及其它免疫性血小板破坏疾病相关。与血小板结合的PA-IgG 数量检测结果,可以作为临床诊断依据,这比其它单一检测方法更有价值。
血小板表面标记
活化前的静息血小板表面抗原的低表达与血小板聚集功能降低相关。表面抗原相关的血小板聚集功能减弱可以是先天的(血小板无力症Glanzmann’s thrombasthenia ;巨大血小板综合征,Bernard-Soulier syndrome,BBS)也可以是后天获得的(脊髓发育不良, 白血病, 再生障碍性贫血,骨髓抑制或毒性)。常用表面标记有,CD41 (gp IIb/IIIa), CD42a (gpIX), CD42b (gpIb), and CD61 (avb3, vitronectin receptor)。
活化血小板检测
活化血小板表面会出现一些新的标记。主要的有两个PAC-1 (活化的 IIb/IIIa)和 CD62P (P-selectin), 它们是对临床有用的活化血小板标记。此外还有CD31 (PECAM)和 CD63 (a lysosomal antigen),也是有用的两个活化标记,并已在临床应用。血小板活化研究的全血标本收集要求使用 19 ga. (或更大)针头,开始吸出的2cc 血注入试管(或弃用),然后将后续血液轻轻注入另一个试管。
血小板生理
血小板( platelets, thrombocyte)是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质。巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少,仅占骨髓有核细胞总数的 0.05%,但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。每个巨核细胞均可产生1000-6000 个血小板。正常成年人的血小板数量是150000-350000 个/μL(150-350×109/L)。血小板有维护血管壁完整性的功能。当血小板数减少到50000 个/μL(50×109/L)以下时,微小创伤或仅血压增高也使皮肤和粘膜下出现血瘀点,甚至出现大块紫癜。可能由于血小板能随时沉着于血管壁以填充内皮细胞脱落留下的空隙;而且,用同位素标记血小板示踪和电子显微镜观察,发现血小板可以融合入血管内皮细胞,因而可能对保持内皮细胞完整或对内皮细胞修复有重要作用。当血小板太少时,这些功能就难以完成而产生出血倾向。
循环血液中的血小板一般处于“静止”状态。但当血管受损伤时,通过表面接触和某些凝血因子的作用,血小板转入激活状态。激活了的血小板能释放一系列对止血过程必需的物质。生成血小板的巨核细胞也是从骨髓中的造血干细胞分化发展来的。造血干细胞首先分化生成巨核系祖细胞,也称巨核系集落形成单位(colony forming unit-megakaryocyte , CFU-Meg)。祖细胞阶段的细胞核内的染色体一般是2-3 倍体。当祖细胞是2 倍体或4 倍体时,细胞具有增殖能力,因此这是巨核细胞系增加细胞数量的阶段。当巨核系祖细胞进一步分化为8-32 倍体的巨核细胞时,胞质开始分化,内膜系统逐渐完备。最后有一种膜性物质把巨核细胞的胞质分隔成许多小区。当每个小区被完全隔开时即成为血小板,一个个血小板通过静脉窦窦壁内皮间的空隙从巨核细胞脱落,进入血流。
巨核细胞增殖、分化的调节机制类似于红细胞系生成的调节,至少受两种调节因子分别对两个分化阶段进行调节。这两种调节因子是:巨核系集落刺激因子(Meg-CSF)和促血小板生成素(thrombopoietin ,TPO)。
巨核系集落刺激因子是主要作用于祖细胞阶段的调节因子,它的作用是调节巨核系祖细胞的增殖。骨髓中巨核细胞总数减少时促使该调节因子的生成增加,Meg-CSF 是一种低分子糖蛋白,分子量约为46000,它与促血小板生成素具有完全不同的免疫学性质。
促血小板生成素也是一种糖蛋白,当血流中血小板减少时,促血小板生成素在血液中的浓度即增加。该调节因子的作用包括:增强祖细胞的DNA 合成和增加细胞多倍体的倍数;刺激巨核细胞合成蛋白质;增加巨核细胞的总数,结果增加了血小板的生成。根据去肾大鼠出现血小板减少时血液中促血小板生成素的浓度不增加的事实,推测肾是产生促血小板生成素的部位。
小血管损伤后血液将从血管流出,但在正常人,数分钟后出血将自行停止,称为生理止血。用一个小撞针或注射针刺破耳垂或指尖使血液流出,然后测定出血延续的时间,这一段时间称为出血时间(bleeding time)。出血时间的长短可以反映生理止血功能的状态。正常出血时间为1-3 分钟。血小板减少,出血时间即相应延长,这说明血小板在生理止血过程中有重要作用;但是血浆中一些蛋白质因子所完成的血液凝固过程也十分重要。凝血有缺陷时常可出血不止。
生理止血过程包括三部分功能活动。首先是小血管于受伤后立即收缩,若破损不大即可使血管封闭;主要是由损伤刺激引起的局部缩血管反应,但持续时间很短。其次,更重要的是血管内膜损伤,内膜下组织暴露,可以激活血小板和血浆中的凝血系统;由于血管收缩使血流暂停或减缓,有利于激活的血小板粘附于内膜下组织并聚集成团,成为一个松软的止血栓以填塞伤口。接着,在局部又迅速出现血凝块,即血浆中可溶的纤维蛋白源转变成不溶的纤维蛋白分子多聚体,并形成了由血纤维与血小板一道构成的牢固的止血栓,有效地制止了出血。与此同时,血浆中也出现了生理的抗凝血活动与纤维蛋白溶解活性,以防止血凝块不断增大和凝血过程漫延到这一局部以外。显然,生理止血主要由血小板和某些血浆成分共同完成。
血液离开血管数分钟后,血液就由流动的溶胶状态变成不能流动的胶冻状凝块,这一过程称为血液凝固(blood coagulation)或血凝。在凝血过程中,血浆中的纤维蛋白源转变为不溶的血纤维。血纤维交织成网,将很多血细胞网罗在内,形成血凝块。血液凝固后1-2 小时,血凝块又发生回缩,并释出淡黄色的液体,称为血清。血清与血浆的区别,在于前者缺乏纤维蛋白原和少量 参与血凝的其他血浆蛋白质,但又增添了少量血凝时由血小板释放出来的物质。
血浆内具备了发生凝血的各种物质,所以将血液抽出放置于玻璃管内即可凝血。血浆内又有防止血液凝固的物质,称为抗凝物质(anticoagulant)。血液在血管内能保持流动,除其他原因外,抗凝物质起了重要的作用。血管内又存在一些物质可使血纤维再分解,这些物质构成纤维蛋白溶解系统(简称纤溶系统)(fibrinloytic system)。
在生理止血中,血凝、抗凝与纤维蛋白溶解相互配合,既有效地防止了失血,又保持了血管内血流畅通。
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