细胞与分子免疫学杂志(J Cell Mol Immunol) 1999 Nov ;15 (4)
曹云新 刘智广 张晓楠
(第四军医大学中心实验室, 西安 710032)
流式细胞术( Flow Cytomet ry , FCM) 是一种对单细胞自动定量分析的新技术, 具有敏感性高、速度快、信息量大和统计学精度高等优点[1 ] , 已在细胞生物学、肿瘤病理学和体细胞遗传学等众多领域得到了广泛应用[2 ] 。在检测细胞周期的变化、 DNA 含量及细胞凋亡等方面, FCM 可为细胞周期的动力学研究提供有力的分析手段。然而, 在细胞周期分析过程中, 由于受到实验设计方案和临床诸多因素的影响, 采样与上机检测的时间往往不能紧密衔接, 因此, 集中检测样品实属必要。本研究旨在探索样品的固定时间和保存样品的实验条件, 以使FCM 的细胞周期分析更为经济实用。
1 材料和方法
1.1 试剂与仪器 细胞DNA 染色的试剂, 为 DNA - Prep Reagent System 试剂盒、仪器为Elite ESP 型流式细胞仪, 均由美国Coulter 公司生产。
1.2 测定标本 人食管癌细胞系Eca109 由本校口腔医院细胞生物室提供。将其在含10 %小牛血清的RPM121640 培养基中( Gibco) , 于37°C、5 %CO2 中培养。
1.3 细胞固定 取细胞密度为109 / L 的培养细胞 1 ml , 置12 ×75 mm 的专用试管中, 离心1000 r/ min ×5 min。弃上清液, 用PBS 离心洗涤2 次, 每次离心800 r/ min ×5 min。然后加1 ml 的PBS 于试管中, 置快速混匀器上充分振荡成单细胞悬液, 再加入4°C 预冷的无水乙醇2 ml , 立即振荡混匀, 用封口膜封口, 置4°C 冷藏室备用。
1.4 荧光染色 取已固定的细胞标本, 离心、弃固定液, 用PBS 洗涤2 次。加入100μl 的PBS 悬浮细胞, 再加入DNA - Prep stain 染料500μl 在室温中避光染色15 min , 上FCM 检测。若有成团细胞, 需用500 目尼龙网过滤后方能上FCM 检测。
1.5 固定时间试验 取同一份培养细胞, 分别固定20 min、40 min、60 min、12 h 、24 h 、48 h 、6 d、12 d 和18 d , 然后按照114 的方法制样, 观察不同固定时间对细胞分布、细胞周期及DNA 表达量的影响。
1.6 FCM检测条件 FCM 检测时, 所用的激光波长为488 nm , 发射波长为525 nm , 激光功率为 260 mm。每份标本均检测5 500 个细胞, 用DNA MultiCycle 软件进行统计拟合分析。
2 结 果
将同一份人食管癌培养细胞分别用乙醇固定不同时间后, 同时上FCM 检测。结果表明, 在细胞分布的二维散点图上, 除固定18d 的标本细胞碎片较多外, 其它各时间点固定的标本的细胞分布位置基本相同(图1) , 细胞DNA 波形图比较近似(图 2 ) 。经DNA MultiCycle 软件进行细胞周期拟合分析, 所获结果见表1 , 可见细胞周期各时相的百分率与DNA 的量基本相同( P & 0.05) 。
表1 固定时间对细胞周期及DNA 表达量的影响
3 讨 论
目前, 用FCM 检测细胞周期与DNA 含量的样品制备方法有两种: 一种是活细胞直接用去污剂(1.0 %TritonX - 100 ) 打孔, 然后用相应的荧光染料染色后上机检测。这种方法制备的标本细胞碎片较多, 细胞保存时间短, 而活细胞又必须及时处理和上机分析, 否则会影响样品测定结果, 因此, 应用上受到很大的限制。另一种方法是用固定剂固定细胞, 检测时洗去固定液, 用荧光染料染色后上机检测。目前, 以FCM 测定细胞周期和DNA 含量使用的荧光染料为碘化丙啶( PI) 。该染料为插入性核酸荧光染料, 可定量地插入核酸(DNA、 RNA) 双链螺旋的碱基对中并与之结合, 但不能穿过完整的细胞膜。因此, 用该染料染色的细胞必须经打孔机打孔或固定剂固定, 使细胞膜皱缩, 以利于染料进入细胞内。乙醇是目前流式细胞术中最常用的固定剂, 固定时间至少要24 h 以上[3 ] 。本文的结果表明: 用乙醇固定较短时间(20 min) 和较长时间(18 d) 都可得到相同的结果。我们用同样的方法, 固定保存了肝、肺等多种不同的细胞, 也得到同样的效果。因此, 本方法为流式细胞仪 DNA 分析样品的固定和保存提供了实验依据。
图1 乙醇固定不同时间的细胞分布二维图
图2 乙醇固定不同时间的细胞周期拟合图
参考文献
1 左连富, 等1 流式细胞术与生物医学1 辽宁科学技术出版社,1997 : 8～19
2 宋根平, 李素文1 流式细胞术的原理和应用1 北京: 北京师范大学出版社, 1992 : 141～176
3 左连富, 等1 流式细胞术样品制备技术1 华夏出版社, 1993 :42～48
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