(一)荧光测量灵敏度
灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标,一般以能检测到单个微球上最少标有异硫氰酸荧光素 (fluoresceinisothiocyanate,FITC)或藻红蛋白(phyloerythrin,PE)荧光分子数目来表示,现在的FCM均可达到600个荧光分子。
(二)分辨率
分辨率的高低是衡量仪器检测量精度的指标,通常用变异系数(CV)值来表示:
CV=D/M×l00%(其中D是分布的标准差,M是分布的平均值)
如果一群含量完全相等的样本用FCM来测量,理想的情况下,CV为0;用FCM测量曲线表示为垂直于横轴的直线。但是在整个系统检测中会带人许多误差,其中样本含量本身的误差、样本在流进照射光区域的微量变化、再加上仪器本身的误差等,实际得到的是一呈正态分布的曲线,CV值越小则曲线分布越窄越集中,测量误差就越小,一般的FCM在最佳状态时CV值均&2%。CV值除了采用以上的计算公式外,还可用半高峰宽来计算,半高峰宽指在峰高一半的地方量得的峰宽,它与CV值有以下的关系:
CV=半高峰宽/M×0.4236X100%
上述公式建立在正态分布的条件下,而实际数据分布常常是非对称图形,故采用半高峰宽所计算得到的CV值要明显小于统计公式得到的CV值,在实际应用中应引起注
意。
(三)前向角散射光检测灵敏度
灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小,目前FCM可以测量到0.2—0.5mm。
(四)FCM的分析速度
分析速度是以每秒可分析的细胞数来表示,当细胞流过光束的速度超过FCM仪器响应速度时,细胞产生的荧光信号就会被丢失,这段时间称为仪器的死时间。死时间越短,则仪器的处理速度越快,一般可达3 000~6 000/s,大型机已达到每秒几万个细胞。
(五)FCM分选指标
分选指标包括分选速度、分选纯度及分选收获率。分选速度指每秒可提取的细胞数。目前台式带分选仪器的分选速度约为300/s;大型机约为每秒上万个。分选纯度指被分选出细胞所占的百分比,目前大型机与小型机分选纯度均可达到99%。分选收获率指被分选出的细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下,分选纯度和收获率是互相矛盾的,纯度高,收获率下降,反之亦然。这是由于样本在流液中并不是等距离一个接一个有序地排列,而是随机的。一旦两个不同细胞相距得很近时,在强调纯度和收获率不同条件下,仪器会作出取舍的决定。因此,选择不同模式要视具体实验要求而定。
流式细胞仪的应用范围 自20世纪70年代以来,随着流式细胞技术水平的不断提高,其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。
目前国内外FCM在医学临床及科研中的应用主要有以下几方面:
①监测细胞免疫状态;
②组织配型与监控移植的排斥反应;
③白血病的诊断及疗效观察;
④遗传性血小板疾病的诊断;
⑤细胞DNA定量及细胞周期的分析;
⑥细胞凋亡的检测;
⑦细胞特异性标志物的测定;
⑧细菌的鉴定。