细胞功能检查在近几年来由于流式细胞仪技术的开展有了很大的提高，不同于其它技术，最大的一点在于流式细胞仪能快速、定量地检测，分析单个不同细胞的功能，并且获得大量同一细胞或不同细胞总体的状况，也就是说常规的一些标本检测即可满足多人份的不同细胞 群体的检查结果
本文主要涉及的是吞噬细胞（包括巨噬细胞和多形核细胞）。影响吞噬细胞的数量和功能的因素很多，其中包括各种药物作用，例如皮质类固醇药物常常引起循环血液中白细胞数量的升高，其机理是主要促进骨髓中的白细胞释放，同时降低白细胞粘附血管内皮的能力至减少了白细胞的血管外移，还有轻℃提高了白细胞在循环血液中的半衰期。正常情况下，中性粒细胞在骨髓中需5-7 天后释放至循环血液中，其半衰期仅为7h，当趋向和进入各种组织中，在1 至2 天内发挥其生理功能，最终不管其功能状况如何（静止或激活），主要经过巨噬细胞的吞噬和粘膜表面的降解来完成。由于中性粒细胞在人体中数量大、半衰期短，在微环境中稍微有变化，即会产生一些复杂的生理作用。本节目的是介绍用流式细胞仪检测及阐述中性粒细胞和巨噬细胞的功能。
吞噬功能
一般来说，吞噬过程大致分为几步：首先是识别，然后相互间接触、结合，最后才是内吞与消化。其中关键的一步在于它们之间的正常接触。当机体调理作用的紊乱和吞噬细胞的分解作用的缺陷，常引起吞噬的异常现象。介导吞噬的细胞表面受体主要是C3b(CR)和FcR 受体。Bassoe 和 Berbnes 运用流式细胞法很好地分析了细菌吞噬现象，指出流式细胞仪测定的两大优点：1. 要求的细胞数量相对较少；2. 白细胞分离步骤不多。因此它特别适用于儿童等低年龄患者。其检测原理是利用吞噬细胞内吞标记了FITC 的细菌，并且保持吞噬细胞细胞膜的完整性，使后加入的EB 染料只能结合未被吞噬的细菌，这样通过流式细胞仪可以区分已吞噬细菌和末吞噬细菌的吞噬细胞等情况。
应用流式细胞仪检测吞噬功能的方案很多，依据被用来内吞的微粒不同而言。目前在台式流式仪上常用的、简单的、直观的方法是利用荧光标记的白色念珠菌作为内吞的对象，当吞噬完成后，加入EB 染料，与未被吞噬的菌体结合，这个吞噬过程可被细胞松驰素（cytochalasin B,5ug/ml）完全抑制，可用作质控对照，在448nm 的波长下，吞噬细胞内的菌体发出绿色荧光，而胞外的菌体发出红色荧光，原理在于胞外被标记FITC 的细菌发出的 FITC 能够激发EB 染料，使其产生红色荧光，而胞内则只有绿色荧光的产生，由于这个方法未被正式接受，现在更常用的是金黄色葡萄球菌来检测中性粒细胞的吞噬功能，下面作一些介绍。
实验步骤
1．金葡菌液的制备：
（1）准备金葡菌，在血平板培养过夜，再挑选菌落在含心脑浸液的琼脂斜面亚培养，最后轻移至肉汤过夜。
（2）Hanks 平衡盐溶液（HBSS）洗涤后，加入FITC（0.01mgFITC/500ul 碳酸盐缓冲液）37℃摇床30 分钟，10000g 离心悬液10 分钟。
（3）PBS 洗涤至少两次，60℃加热1 小时灭活细菌。
（4）两次PBS 洗涤，并调整细菌悬液，使其OD 为0.35（620nm）。
（5）每1ml 菌液，加1 滴甘油作为一管，—70℃冷冻保存。
2．中性粒细胞悬液的制备
（1）采集10ml 新鲜肝素抗凝血（不能使用枸椽酸盐或EDTA 抗凝）。
（2）先加入20mlPBS 混匀，再叠加至15mlFicoll-Hypaque 分离液面上，室温下400g 离心30 分钟。
（3）除去红细胞层以上成分，加入3ml3%Detran T 500 和15ml PBS（要求37℃），混匀后置于37℃温浴45 分钟，以沉淀红细胞。
（4）收集棕黄色层液体成分（含中性粒细胞），300g 离心10 分钟，去除上清液，加入3ml蒸馏水轻摇20 秒后，立即加入至少30ml 适量的PBS，以除去残余的红细胞，300g 离心10分钟，保存于PBS-gel 液（2mMNa2-EDTA,5mMdextrose,0.1%gelatin）。
（5）计数细胞，调整细胞浓℃为2×106，并且用台盼蓝或碘化丙锭（PI）在流式细胞仪检验中性粒细胞的浓℃或活性（＞90%），待用。
3．上机前准备
（1）取冻存的金葡菌液1ml 每管，使用时需要用新鲜血清调理（1ml 菌液/4ml 血清）。
（2）取5ml 中性粒细胞悬液（2×106/ml）,加入经血清调理的菌液管中混匀，立即提取1ml液体放入1ml 已冰浴的含0.02%EDTA 的生理盐水管（12×75mm）中，置于冰水中以用作零对照管，以后每隔15 分钟取一次样，同样处理，直至1 小时。
（3）在流式细胞仪上488nm 激光下测定525nm 的绿色荧光强度，以判断细菌的吞噬数量。细菌与中性粒细胞理想的稀释比例为20：1，一般通过调整菌液的不同浓度，来计算白细胞的标准数量；通过流式荧光图表，估计白细胞的吞噬功能。目前吞噬功能检测试剂已商品化，易使用且重复性好。
注：为了估计细胞外荧光强℃，可在每管中加入1ml 台盼蓝（3ml/ml）混匀，立即检测胞外荧光强℃是否相同，若有胞外荧光强℃降低，说明有些菌体吸附于细胞膜外表面上，因为台盼蓝在2-5 分钟内不能透过细胞膜。
临床解释
吞噬功能异常常见于先天性或获得性的某种疾病，由于中性粒细胞本身和血清补体的调理缺陷造成。如新生儿和青少年牙周炎、肺炎、支气管炎、淋巴结肿大等。骨髓中若将未成熟的中性粒细胞释放至血液中，由于其表面含有大量负电荷物质，可导致其吞噬功能缺陷。另外由于脾切除引起的tuftsin(特夫素)缺陷，降低了中性粒细胞的吞噬功能，导致机体容易发生感染。肌动蛋白的整合和微丝作用缺失也容易影响吞噬过程的正常进行。补体C3b 的缺陷亦可以引起吞噬功能的改变。
氧化代谢方面
流式细胞仪非常适合于检测中性粒细胞的氧化爆发反应功能，与常规方法而言，它仅需少量血样标本（最少可至5000 个cell/每管），在儿童患者采样时非常重要，并且这种方法得出的结果定量和客观。作为氧化磷酸化过程中最终的电子受体，氧在中性粒细胞激活的一系列作用中占据重要角色，可以快速形成多种活性氧高能状态，如O2ˉ、H2O2、OHˉ等，其来源主要来于线粒体氧化、微粒体细胞色素P450 系统、NADPH 氧化酶等，这些可被氰化物等抑制。实验表明，线粒体电子传递链的阻断可引起氧自由基大量增加。机体对外来病原体的最早防御，主要由组织细胞中的过氧化物酶、裂解酶、谷胱甘肽及其氧化酶、维生素 E、A、C，不饱和多脂肪酸等来起作用，因此测定中性粒细胞激活时的胞内氧化活性强度可有助于了解机体细胞对炎症反应的能力。
过氧化物水平
用流式细胞仪测定H2O2 的水平已经发展了许多年，目前这个方法的主要原理是引用 DCFH-DA 非荧光分子探针进入细胞作为易氧化的底物。由于DCFH-DA 具有亲脂性，很容易通过细胞膜，在胞内被脂酶分解，去酰基形成有极性的DCFH，但DCFH 不产生荧光，由于它的极性，可以在胞浆中与MPO 阳性颗粒接触，其中的H2O2 和过氧化物酶能够氧化 DCFH 为DCF，在流式细胞仪525nm 处检测到绿色荧光，其DCF 形成量与细胞氧化产物水平呈正比例关系，因此，测定荧光强度就相应于细胞内过氧化物的水平。许多研究利用这项技术在HL-60 细胞、内皮细胞、软骨细胞、肾脏上皮细胞、神经元、中性粒/单核细胞等测定胞内H2O2 的水平，但是由于DCFH-DA 也可以流出胞外，特别对具有活性P 糖蛋白系统的细胞，不适合利用它来检测，因此在任何情况下，主要的关键在于把非活性细胞作为质控，来比较活性细胞的过氧化物水平。最近有证据表明，DCFH 探针不仅仅针对H2O2 ，NO 的存在，也可使DCFH 反应生成DCF，当然在中性粒细胞的正常激活下，由于缺乏L-精氨酸， NO 不易产生，然而在特殊的条件下，应考虑它的存在，可以检测NO 水平作为证明。实验步骤（全血或纯化的细胞悬液皆可应用）
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