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免疫磁性微球技术专题

免疫磁性微球技术专题

2013/12/16 来源:生物探索
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导读
免疫磁性微球是免疫学和超顺磁性磁珠相结合而发展起来的新型材料,是一种包被有抗体或具有抗体结合功能的超顺磁性微球。免疫磁性微球可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成复合物,此复合物可被磁场滞留从而与其他杂质分离,该过程被称为免疫磁性分离。这种新型分离纯化技术被广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、免疫纯化、免疫沉淀等领域。
技术简介
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免疫磁性微球(Immunomagnetic Microspheres,IMMS),或称免疫磁珠(Immunomagnetic Beads,IMB)是免疫学和超顺磁性磁珠结合而发展起来的一类新型材料。免疫磁珠是包被有抗体或具有抗体结合功能的超顺磁性微球,当它与含有靶物质的样品混合孵育时,可与靶物质特异性地结合而形成具有磁响应性的复合物,此复合物可被磁场滞留,从而与样品中其他杂质分离。免疫磁性分离简便易行,分离纯度高,保留靶物质活性,且高效、快速、低毒,可广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、免疫纯化、免疫沉淀等领域。

核心原理
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磁性材料在高温条件下,或是磁性颗粒的粒度很小时,其磁性很容易随周围的磁场改变而改变,磁体的极性也呈现出随意性,难以保持稳定的磁性能,这种现象就是超顺磁效应。超顺磁性磁珠能在外部磁场的作用下迅速聚集,当磁场撤离后即可重新分散而不带有剩磁,这种特性使其作为一种新型的分离纯化基质被广泛用于生物活性物质的分离纯化技术上。理想的磁珠具有均匀的球形、由具有超顺磁性的铁质核心及高分子保护外壳,大小从50~10000nm不等。表面常带有化学功能的基团,如-OH、-NH2、 -COOH和-CONO2等,使得磁珠几乎可以偶联任何具有生物活性的蛋白。磁珠与多数生物高分子如多聚糖、蛋白质等具有良好的生物相容性。在生物工程,特别是在生物医学领域应用,具有良好的生物相容性是非常重要的。

免疫磁珠用于细胞分离和提纯
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在临床医学和基础医学研究领域,经常需要对各种需要的特定种类的细胞进行分离,流式细胞分选技术是一种目前使用较多的细胞分选方法,其原理是用荧光标记抗体的细胞受光激发后在电场中运动方向会发生改变,藉此来将抗体阴性细胞分开,但该方法存在费用高、分离时间长,细胞处理量小等缺陷。

应用免疫磁珠分离细胞是细胞分选的一大突破,该方法方便、快速、分离细胞的纯度高,具有较好的生物活性。使用免疫磁珠进行分离细胞有两种方式;直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法,称为阳性分离;用免疫磁珠去除无关细胞,使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。免疫磁珠技术可用来分离人类各种细胞如红细胞、外周血嗜酸/碱性粒细胞,神经干细胞、造血细胞、T淋巴细胞、人类关节滑膜细胞、树突状细胞、内皮细胞、及多种肿瘤细胞等。

图1 免疫磁珠用于细胞分选的示意图

免疫磁珠用于免疫检测
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免疫磁珠的超顺磁性使固/液相分离更加简便,可省去过滤等繁杂的传统操作,磁珠微小,比表面积大,与生物分子等物质偶联时容量大,悬浮稳定性好,有利于抗原抗体反应顺利进行,因此,免疫磁珠在医学及生物学检测、环境监测及食品安全检测等领域有着很好的应用前景。

在免疫检测中,免疫磁珠替代传统酶标板作为固相载体,包被在磁珠表面的抗体(或抗原)可与环境中特异性抗原(或抗体)结合,形成抗原-抗体复合物,在外加磁场作用下,使特异性抗原(或抗体)与其它物质分离,这种分离方法使整个反应在液相中进行,克服了放射免疫测定和传统酶联免疫测定方法中抗原抗体反应发生在固/液相之间等的缺点,具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好等优点,因而磁性粒子可广泛应用于生物医学检测,如检测体内各种抗原或抗体,癌细胞、环境、生物样品及食品中的微生物。更重要的是,该方法能够将待检测物质分离出来,可用于微生物的富集培养及细胞(如癌细胞,巨核细胞及T细胞等)分选等的研究。

免疫磁珠还可与化学发光、荧光免疫等技术相结合,从而极大地提高检测灵敏度,对于极微量物质的检出及定量测定等都是一项具有很好应用前景的检测方法。

图2 免疫磁珠应用于免疫检测反应的示意图

免疫磁珠用于单抗免疫纯化
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单克隆抗体是B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生的,其重链和轻链所形成的结构域可以识别和结合特异抗原。至2007 年,FDA 已批准了20 多种治疗性单克隆抗体药物,约一半用于治疗癌症,多个已成为年销售额超十亿美元的“重磅炸弹”药物。全球单克隆抗体药物的市场增长十分迅猛,有约200 多种单抗在临床实验,占整个临床生物技术药品总数的三分之一多,其中四分之一在临床三期或等候批准。

单抗药物的迅猛发展对抗体纯化工业提出了新的挑战。目前,主流的抗体纯化生产主要包括以下步骤:1、 发酵液澄清; 2 、抗体捕获;3 、抗体精细纯化;4 、抗体浓缩洗滤;5 、抗体过滤除菌/制剂。在抗体捕获阶段,主要应用蛋白A亲和层析技术从发酵上清液中提取抗体。蛋白A是一种从金黄葡萄球菌细胞膜上提取的蛋白,具有5个IgG结合结构域,能特异性地与抗体Fc端结合。传统的层析技术存在其固有的缺点,包括:发酵溶液需进行澄清操作;层析操作耗时长,仪器昂贵;配体脱落等问题。

应用蛋白A包被的免疫磁珠纯化技术无需复杂的层析设备,对样品的澄清度没有限制,只需要简单的磁性吸附步骤即可很方便快捷地从单抗表达产物中分离单抗,有效解决了传统层析技术的不足之处。

图3 磁性纯化抗体操作流程图

图4 磁性免疫纯化与传统层析纯化的对比图

免疫磁珠用于抗原纯化
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高质量的抗原制品在临床检验中成为高灵敏度免疫检测试剂必不可少的组成成分。抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等,须经提取纯化才能被使用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取,一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取,蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等(例如AFP从脐带血或胎肝中提取)。

重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外,其他杂质少,而且无传染性,但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份,用于ELISA,在反应中可出现假阳性,因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒(HCV)尚不能培养成功,而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。

目前检测抗HCV ELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中,不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子量太小,往往难于直接吸附于固相上。

应用抗体与目标抗原之间的特异性亲和吸附作用,表面包被抗体的免疫磁珠可用于高纯度抗原蛋白的纯化。与传统的金属离子螯合亲和层析、离子交换、疏水层析相结合的蛋白多步层析纯化步骤相比,由于抗体对特定抗原的结合具有极高的特异性,因此一步纯化即可得到纯度大于95%的抗原蛋白产品,大大简化了纯化周期,可为临床免疫检测提供高品质的抗原标准品。

图5 免疫磁珠纯化抗原操作流程图

用作靶向释药系统的载体
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肿瘤靶向治疗是利用特定的载体将药物或治疗因素选择性地定向于肿瘤组织,提高肿瘤组织局部的药物浓度,达到提高疗效,降低毒副反应。免疫磁性纳米药物微球具有磁靶向和抗体特异性双重靶向功能,可提高药物在肿瘤部位的浓度和减少对正常细胞的毒副作用,成为在临床上使用的一种特异靶向药物载体。

免疫磁珠作为靶向释药系统的载体可使免疫磁性微球上的抗癌药物更易与癌细胞接触,服用这种制剂后,在体外适当部位用一适宜强度的磁铁,将磁性微球引导到体内特定靶区,提高了杀伤癌细胞的效果。很多研究者使用不同的方法制成了针对不同癌细胞的免疫磁珠,作为靶向释药系统的载体并在实验中证实这种释药载体具有良好的功效。

常见问题与解答
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如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性?

答:可以先将抗体与样品进行孵育,形成抗体-抗原复合物,再用Protein A磁珠捕获复合物。这种方法可以提高抗体与抗原的结合效率,并降低磁珠与样品接触的时间,从而提高沉淀产物的特异性。对于蛋白质/核酸共沉淀或染色质免疫共沉淀也推荐使用此法。

如何提高抗体洗脱效率?

答:抗体与Protein A配基亲和度太高导致抗体洗脱效率低,可以通过降低洗脱缓冲液的pH值(2.5~1.9)、增大洗脱缓冲液的离子强度(可选用2~3M MgCl2)或延长洗脱时间,提高抗体的洗脱效率。但应注意抗体在低pH条件下容易形成聚集物,抗体洗脱产物应马上用碱性缓冲剂(如Tris、HEPES等)调节pH至中性。

如何解决磁珠易粘附耗材的现象?

答:建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外,磁珠反应体积应占反应容器体积的1/2或以上,反应容器体积过大会导致粘附在容器壁上的磁珠增多。在缓冲液中添加0.01% ~ 0.1% 的非离子型去垢剂(如NP-40、Tween-20或Triton X-100)可以有效降低磁珠对耗材的粘附。

磁珠在使用过程中出现结块现象?

答:磁珠在使用时出现结块现象使得一般振荡不能打散磁珠使其均匀分布,出现该问题的原因是磁珠在磁场中放置太久而使磁珠牢固的结合在一起。用超声波水浴处理2min即可打散磁珠使其重新分散,但应注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落,所以磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。

磁珠如何再生?

答:经过多次使用后的磁珠可以用1% TritonX-100或0.1% SDS洗涤再生,具体步骤如下:(1)使用后的磁珠10mg,加入5ml 1% TritonX-100或0.1% SDS,振荡均匀,室温混合10min;(2) 于磁性分离器上分离固液,吸去上清液,马上加入5ml 含0.01% Tween-20、50mM Tris buffer(pH7.5)溶液洗涤磁珠3次;(3)洗涤后磁珠加入1ml 含50mM Tris 、0.1% Tween-20、0.01% NaN3溶液,混合均匀后4℃保存。

技术支持
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本专题资料由海狸纳米科技(苏州)有限公司提供并参与校对。海狸发源于美国麻省理工学院生物医学工程中心。公司以具有自主知识产权的前沿生物纳米表面技术为根本,定位于生命科学研究、生物医药研发和疾病诊断行业的全球市场,专注于多个领域的高端生物耗材和生物纳米材料的产业化。“海狸”的口号是把高端产品做成常规,把常规产品做到极致。海狸公司的BeaverBeads™系列免疫磁珠具有高度均一的IgG结合能力,一步纯化可从血清样品中分离出纯度大于90%的抗体。

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