乔杰:生殖遗传学进展及单细胞测序的应用研究
2015/08/24
北京大学第三医院院长乔杰教授作了题为“生殖遗传学进展及单细胞测序的应用研究”的大会报告,重点讲述了PGD/PGS的必要性、临床应用,以及最新应用于生殖医学领域的MALBAC技术,并对其未来发展做了预测。

2015中国遗传学会大会于8月14日在云南昆明正式开幕,大会主题“遗传多样性:前沿与挑战”,本次会议是中国遗传学会的学术交流大会,是全面展示中国遗传学研究的最新进展的学术盛会。

北京大学第三医院院长乔杰教授作了题为“生殖遗传学进展及单细胞测序的应用研究”的大会报告,重点讲述了PGD/PGS的必要性、临床应用,以及最新应用于生殖医学领域的MALBAC技术,并对其未来发展做了预测。

乔杰院长表示,在临床应用中,染色体核型分析检出率低并且不能明确异常染色体来源,局限了其大规模使用。MALBAC技术是谢晓亮教授研究组创建的一种新的人单细胞全基因组测序技术,它具备准确性高、基因组扩增均匀且覆盖率高、能检测单个细胞中与遗传疾病相关的染色体异常和DNA序列变异、可用极体进行测序等技术优势,已成熟应用与生殖医学领域。最后,乔杰教授对PGD的发展进行了预测,她表示,与单细胞发展历程相似,表观遗传学正成为主流。在下一个PGD新技术的出现也许来自表观遗传学。

以下为演讲文字实录:

我们所有起重要功能的蛋白、DNA到基因,从生殖来说,生殖遗传对于临床和基础的结合是在逐渐发展的过程,从遗传学上,从群体遗传,细胞遗传,分子遗传,药物遗传等等,后边辐射出目前在研究中的、从微观到宏观等一些跟遗传相关的。归根到底,我们是希望有一个好的方法去告诉我们的遗传诊断,从细胞遗传学的检测到分子遗传学的方法到我们现在的比较基因组杂交方法的检测,那么这些方法是随着我们各项技术的发展逐渐可以在人类的遗传学诊断上应用的。像Down Syndrome到后来我们能够从染色体检查中就能发现,那么从发现到我们怎么样能够在中孕期把他阻断,再到我们怎么样能在胚胎期就把它查出来,不让妇女去承受中孕期流产或者出生以后家庭要去承担一个沉重的负担,对于社会来说,抚育一个Down Syndrome的孩子可能花费大概在100万左右。对于一个家庭来说,绝对不是100万这个钱的数字,更是精神上的痛苦。所以生殖遗传就有了越来越重要的意义。

而回归到总体的人类生殖,近年来,总体生育率的下降是非常的明显。不孕不育和心脑血管疾病,癌症并列成为了目前影响人类健康的三大疾病。它又是一个特殊的缺陷,除了对于身体健康和家庭影响之外,它实际上更多地还影响到了一个社会总体的和谐。而流产和出生缺陷同样是严重的问题。这三个加起来对于出生人口的质量的影响是非常大的。所以我们医生所看到的还只是冰山一角,可能有更多地要去做。这是每天早上在我们生殖医学中心前面排队的人群,这张照片是我们在5月11号拍的,就是母亲节的那一天。大家都在享受母亲节的快乐的时候,这些家庭只为了一个非常简单地目标,就是去成为母亲,在就医的路上奔波,非常不容易。那人类生殖辅助技术有了以后,确实是给这些家庭带来了福音,基础研究起了很重要的作用。

从1959年到1978年,兔子第一例体外受精的成功到人的第一例的成功经历了非常漫长的岁月。而人成功之后,到能够非常成熟地在临床上应用,同时在应用的过程中又有各种适用于不同疾病的延生技术的诞生。那么也是经历了不断发展的过程。那么非常重要的呢是到现在为止600多万的试管婴儿诞生了。但是,我们可以看到,至今为止它的成功率,我们报的成功率为40%左右。而这个成功率是什么,是我们的临床妊娠率,叫clinical pregnancy rate。也就是说,超声波看见妇女的体内有一个怀孕的孕囊了叫临床成功。但对于一个家庭来说,他所需要的是生育一个健康的孩子。那真正的活产率,活的健康的孩子的出生率只有30%左右。所以这样一个问题的存在,关键呢是对人类生殖的认识还是比较少的。那么精子卵子受精的过程,受精以后呢怎样去植入,这个胚胎的质量怎么样,非常的重要。所以这个种子,土地,微环境这三个是影响整个人类生殖最重要的几个方面。那么1978年诞生的是常规的体外受精胚胎移植。就是把精卵放在体外,成了胚胎了,那么给他种回去。1992年就有了植入前的遗传学诊断,它的适应症呢是单基因的遗传病,染色体病和可能生育危险患儿的人群。但是从1990到现在呢有很漫长的一个发展过程。实际上呢就是在生殖遗传上的认识受了很多的制约。尤其是因为人类的胚子和胚胎是非常少的细胞,所以这个技术受非常大的影响。所以我们可以看一看中国的这个数据。2009、2010、2011年,我们的活产率只有31%-32%。那么这两年的数据没有出来,实际上还是这样一个数据。而常规体外受精(仅仅处理了精子,然后把有活力的精子打入体内的这样一个技术呢)其实只有10%的活产率。那么对于供精的人工受精,就是用了好的精子,不是有问题的精子,这个成功率能有20%。把胚胎冷冻之后也能达到30%的成功率。

那么我们对比一下国际上的进展,我们拿美国为例。从治疗量上面来看和我们中国去比,它现在比我们少大概10万左右的治疗量。所以中国现在是需要接受生殖辅助技术治疗和能够治疗的都是量最大的一个国家。那这个数据显示的就是不同情况下的成功率,我们看深蓝的这个标记就是常规的、俗称的试管婴儿的,我们叫新鲜的正常情况下我们用自己的精子卵子的成功率。那么在美国,它这是4个,下边标注的96是它生殖中心一年所做的数目,做的量是相对比较小的。而我们国内呢,大的中心大概是做一万例一年,小的中心做三五百例,那是最小的了,做三五千例的是中等的。所以现在国内总体上在临床治疗的水平上是比较高的。那么我们看到它各种治疗周期数,因为考虑到治疗周期数太少可能会影响质量,但总体上还是差不多的。那刚才显示的中国全国的数据,我们的活产率在31%,所以说应该跟国际的水平目前是持平的。所以不管是中国还是世界,我们看到我们治疗的成功率只有30%左右。

这个是WHO在2005年提出的策略,希望在2015年人人享有生殖健康。那么当时也是我们生殖学会成立的时候。而这十年过去了,我们离人人享有生殖健康这个目标差得太远了,影响的因素是非常非常的多。那么其中呢有遗传的问题,有环境的问题。那我们的技术是在不断地发展。而植入前遗传学诊断呢逐渐地有了更好的技术的运用。应该为治疗,为提高成功率,为提高生育一个健康孩子的成功率提供了一个有利的技术和条件。

所以植入前遗传学诊断PGD逐渐过渡到PGS Screening。同时我们用新的技术,单细胞测序技术可以把PGD,PGS结合在一起,就更有利于相对用一个细胞拿出来做诊断去给一个胚胎一个定义这样的办法。那么PGD和PGS用于遗传学的诊断和筛查主要也是根据诊断方法的不同,能够做单基因的诊断,或者染色体的数目,或者染色体的结构,随着技术的发展,能够诊断的内容越来越多。总体上PGD PGS的必要性它是跟因为胚胎的遗传改变相对的比较多。那么从染色体的结构上,不管是数目的异常,结构的异常。从基因突变上,不管是单基因多基因,同时有线粒体遗传,表观遗传,所有的这些都是与出生缺陷有关系的。而除了这个整倍体,三倍体,四倍体这个胚胎一般来说不能存活之外,其他都是有存活的可能性。那就给未来的流产,出生缺陷带来了可能性。所以呢PGS,PGD的重要性就是有可能在植入前把这个胚胎做一个诊断,那么避免后来的引产,出生缺陷的一些风险。而在这个过程当中,我们对整体的,胚胎发育的过程的遗传,表观遗传和基因表达的精细调控的认识就变得特别的重要。那前面谈到的这个必要性里边呢,在这显示的,染色体异常比例是比较高的,有百分之三十,百分之七十。在卵裂期的胚胎,我们在体外看到的也只有40%的几率能够发育成囊胚。所以我们在辅助生殖技术的研究过程中呢,因为在体外培养的时间过长,要求的接近人类自然培养环境的要求就越高。刚开始,我们是两天的胚胎移植,后来三天的胚胎移植,因为越在体外的培养时间长,我们能筛选出更多的胚胎来。但同时,如果体外培养的条件不好,也会对胚胎造成更大的影响。所以每一个技术在人类应用的时候利和弊都要做充分的考量。那么现在呢,总体上囊胚培养的技术比较好了,可以培养到5天,6天,那么筛选出相对更好的胚胎。那么即使是在目前的技术上也只有40%左右的几率能够发育成囊胚。那么如果有了囊胚,我们在生物诊断技术当中就有个更好的,可能不止一个细胞,可能有三四个细胞。而在卵上,我们只能做集体的活检。在胚胎期只能拿一个细胞。如果拿多个细胞的话,对他的全能性的影响还是影响比较大。那么即使拿一个细胞,在我们Day 3的时候,胚胎6到8个阶段,取一个细胞,我们现在发现影响比较大,所以目前做囊胚是最好的。那么从技术上呢最开始是PCR单细胞来做单位点突变的研究。那它的问题是相对的费时,同时,等位基因的脱扣率是比较高的。1992年呢,FISH是对于少数染色体可以做了,但是也有颜色的问题。那么Array CGH/SNP有了以后呢,能够做全体染色体数目和结构异常的一个相对的筛查。所以从PGD可以增加到PGS Screening这样一个过程。而近年来的一个高通量的测序在单细胞领域里面的应用应该说是能够同时去诊断单基因病和染色体疾病的开端。我们也期望在发展的过程当中,更进一步地去精确诊断的技术。因为对于胚胎来说,即使是2%、5%这样的误差,如果是这样的孩子出生,大家都可能想象的到,你做一万例,即使是10个孩子出生,对这些家庭来说也是非常沉重的负担。所以在人类应用的时候我们都是要期待更加精细化。

所以对于精准医学在生殖医学的讨论可能更多的我们是说,我们一直都在路上,在做着这个工作。那么细胞遗传学的方法是我们用的最多的,那它的缺点呢就是要细胞培养,周期长,人工耗费的也大。同时微缺失是不能检测的。所以制约了产前诊断的开展。那么这个核心分析做为非整倍体诊断的一个新标准,我们至今还在用,但是在单细胞上,这个核型分析是比较困难的。而分子遗传学的发展包括PCR技术的发展,都给我们这样一个机会,但是对于等位基因脱扣,对于PCR这个诊断技术难以克服的话,对于我们未来的应用是有影响的。所以数字PCR的应用到原位的FISH杂交,到单细胞FISH的应用,再到FISH去筛查非整倍体的精子,那么到比较基因组技术,实际上在这样一个发展的过程当中,对于单细胞的应用都给了一个特定的机会,整体应用在比如说肿瘤的研究,血液系统的研究之后,逐渐应用到我们这个单细胞的技术当中。

对于Array CGH和SNP在生殖遗传领域的应用,我们的实验流程跟其他都是一样的,那么我们首先做的是脐血啊,染色体啊,羊水这样的一些研究之后,我们就逐渐过渡到单细胞的应用上。那么不管是在总体的应用和单细胞的应用上,核心分析和SNP都有相应的问题。这是我们临床中碰到的,和正常的男性相比,和正常的女性相比,综合下来,相对的不一致性。不管CGH,SNP,我们拿它来和我们现在叫的新一代测序技术NGS去相比,他们都是有利有弊,即使是新一代的测序技术,大家也在提高,对临床上来说,我们要求第一就是精度是最好的,拿等位基因脱扣率作一个代表来说,如果这个脱扣率高,那么在单细胞扩增过程当中扩增的误差大,对于我们的诊断呢影响就会多。第二个我们要求的就是耗时,如果时间长,像48小时,那这个胚胎在体外没法继续培养了,必须把它冷冻起来,等你都做完诊断以后再把它解冻,再去移植。而这个胚胎是经过活检以后的胚胎,活检以后的胚胎再冷冻再解冻,目前看成功率还是可以的,只敢这么说,因为对人类的影响来说短时间,我们现在从追踪、随访到出生,实际上对于一个总体可能的影响,我们要追踪到他四十岁、六十岁、八十岁,要看各种,比如说我们做这个胚胎活检的影响,我们在老鼠身上就发现它可能在老鼠到青年或中年的时候走迷宫的能力下降,那我们认为它认知能力下降,把它的脑子拿出来做研究,我们发现它一个神经髓鞘蛋白有问题,那人身上会不会有问题呢?我们现在PGD做过胚胎活检的孩子才只有十几岁、二十岁,但是刚才我为什么那么感兴趣问贺林院士您是怎么做脑子的基因测序啊,因为我们没有办法拿做过PGD胚胎活检的孩子的脑组织去研究他的神经髓鞘蛋白是不是有问题,他到四十岁、六十岁会不会有老年痴呆,如果他会有的话,那我们这个技术可能就不适合在人类身上广泛应用,因为每个技术你在给病人应用的时候一定要考虑利和弊,你能解决的问题和你可能给他带来的问题是什么,所以有效性和安全性一定是我们要考虑的最重要的两个方面。

所以高通量测序技术用于胚胎染色体筛查呢,我们花了很多精力,在国际上不同的组织、通过不同的方法都去在研究,就是希望这个扩增的准确性要好,误差会低一些。那么对于高通量测序我们用比较低的测序深度就能够做染色体整倍性的测序,那么这个已经是可以的了。我们和谢晓亮教授刚才介绍的我们在《Cell》上发表文章,用这种MALBAC扩增技术,它这个技术就是一个相对的到目前为止在扩增上最准确最高效最经济的一个胚胎筛查的技术。那么同时我们经过二次创新呢,能用统一细胞把染色体的筛查和单基因的诊断都做了,那么就减少了我刚才说的取材的创伤性大,能够在最小创伤的情况下去做相对最多的信息量的诊断,这个就是比较需要的。那这张片子显示的是我们做PGD 15年后的一个总结,现在看这一个回顾,总体上对我们目前所应用的一些技术,都各自有优点有缺点,还需要做更多的探索。我们对NGS寄予更多的希望,因为相对来说它的分辨率、有效性都是比较好的,尽管它的仪器设备的费用还比较高,但是每一个测定成本的降低还是能让更多的病人享受到这样一个好处,所以我们在临床上病人捐赠我们的胚胎上,我们进行了对新方法和老方法扩增测序的一个比较,一个是看不同细胞之间有没有差别,一个是看不同方法之间有没有差别。现在看呢,总体上就是在卵裂期的胚胎去做活检的话,临床上卵裂期一般是3天,6-8个细胞的时候,细胞的嵌合型是比较强的、嵌合率是比较高的,用哪一种技术来影响呢并不是特别大。用三种技术进行检验做了一些对比,总体上也有差别,每一种技术目前还都完善,这也是我们不断在追求新的技术去更完善的原因。在临床上呢,我们现在得出的结论就是Day 3的胚胎是不太好的,而用Day 5的囊胚期,因为囊胚我们取的细胞可以多两三个,不同部位的自养细胞我们做了一个研究,还是相对的都能够代表内细胞团,代表率能够有百分之九十九点几,这个还是相对可靠的。所以我们跟病人交代也只敢交代相对可靠,依然会有不到1%不能代表内细胞团,同时等位基因脱扣率,虽然用了MALBAC比PCR明显减少,但依然也还会有这样1%-2%的脱扣率,所以还在研究更好的方法去做这个探索。

我们看到在Cell上不断发表应用单细胞测序技术在不同的肿瘤上进行的研究,之后我们用MALBAC技术在人类精子上做的研究,之后就用卵子做的研究。那么MALBAC技术最大的一个好处就是利用一个特殊的引物使扩增子的结尾互补成环,这样就防止了DNA的指数扩增,解决了扩增的偏移问题,同时也能够保证用一个单细胞大概有90%以上的基因组扩增率的覆盖幅度,所以这样一个技术在临床上应用以后还是一个比较好的,特别是对于集体,因为在一个卵母细胞取出来的集体还是非常小,在过去的扩增技术上使用起来是比较困难的。现在我们就把集体活检和囊胚的活检结合起来,对于母原的遗传病就有一个double confirm的作用。

我们和两个项目组合作,谢晓亮项目组和汤富酬项目组,这些新的方法给我们各个领域都提供了一个更好的研究空间。那利用单细胞的转录组、甲基化组和环形RNA技术,我们在胚胎研究上也是在不断深入,那谢晓亮的这个年度方法在Nature Methods上报道以后可以看到一个更多的应用。我们在临床上应用几个病例都非常成功,这个病例就是一个X-连锁外胚层发育不良,她现在有一个孩子是7岁,没有汗腺、没有毛发、不能坐立,智力也不到1岁,所以这个家庭是迫切需要生育一个健康不携带致病基因的孩子,那我们用这样一个方法给她做了集体和囊胚期细胞的联合活检,这个孩子已经出生了,观察到现在也是非常好,也是正常的孩子。第二例是一个多发性软骨瘤,他就是骨头上,大概100多块骨头不断地在长瘤子,不是恶性的,但是在他的一生当中不断地需要手术,走路也是跛型,颈椎在她生育这个健康孩子之前也做了手术,所以对她来说是很痛苦的,她在了解到这样一个技术之后她就要求能不能她自己来做这个实验,实际上她这个用单细胞PCR测序是可以解决的,因为他爸爸的情况并不重,他的情况重,他认为有新发突变,所以她就希望你们能不能有新的技术帮我尽可能的选一个我的孩子不会再比我更严重,所以我们就用她的胚胎给他做,确实发现她有新发突变,也有一些染色体异常的,如果在过去我们只能筛出他染色体异常的和新发突变分开做,只能做一种,那对她来说就只能做她原来那个突变,我们现在新的方法是把她的染色体异常和新发的突变都给她去掉,新发突变是不是有意义,其实我们并不知道,但是我们把这个胚胎留着,至少在目前我们的知识上给她检查出来既没有她目前有的单基因病,同时也没有新发突变,同时也没有染色体异常,就给她移植回去了,他是比第一例早出生的,9月19号就出生了,现在孩子也很正常。所以这个技术在临床上是能给这些病人带来很大益处的,我们也逐渐在对比新旧方法能给病人带来哪些好处。但是因为深度测序给了更多的information,那么多的information对于一个胚胎的判断起哪些作用,我们现在非常慎重,都只在研究阶段,因为这些信息并不能够判断一个胚胎也就是一个人的生死,所以尽管对于这种严重的致死致残的遗传病会给他选择一个健康的胚胎,一般的疾病还是不建议做遗传学诊断的筛查,因为有更多的伦理学问题,但是这个技术用来做研究和对未来更多的探讨还是非常有意义的。

比如说我们用这个MALBAC来做人类卵母细胞减数分裂过程中染色体重组的研究就非常有意义,这个发表在Cell上面,因为克服了几个困难,一个是第一极体、第二极体都能取出来,卵母细胞核也要正常,后面它也要正常的分裂,在这个过程中,我们是拿这样一个活检的单细胞做了183个细胞的测序,发现用第一极体、第二极体来推断卵母细胞核,过去我们只拿第一极体做诊断,发现还是有一些异常,不能够完整地代表卵母细胞核,现在通过第一极体、第二极体双检查能够完整地推断卵母细胞核。拿病人捐赠的这个做了判断后,我们就可以在临床上进行应用,这个利用单倍体的第二极体进行基因组分型也是特别有意义的。所以通过这样一个研究,对于极体测序在植入前诊断中的应用除了实现卵母细胞和极体的单细胞测序之外,对于准确的判断雌核的意义、对于遗传病就是对于单细胞位点突变,可能能够三重确定一个胚胎健康与否,那么通过连锁分析能够除外更多可能的发生就特别有意义了。同时我们现在最新做的就是只用0.01X的测序就能够达到很好的23对染色体的筛查,信号也很稳定,这样胚胎诊断的成本就可以降到七八百块钱,这个在临床应用也是非常有意义的。那我们把它和目前应用的比较基因组杂交和SNP进行对比,现在芯片在国内卖差不多要两三千块钱,再加上机器的价钱,这个成本还是非常高的。这个研究发表之后Nature和BBC News等都进行了一系列报道,因为对这个期望值很高,希望能够提高这些疑难辅助生殖技术的成功率,同时无创的卵母细胞的基因检测,那么这些分析就都非常重要。这个孩子的出生可以说给更多的遗传病家庭带来了希望,,那么当时正好是总书记和刘延东副总理五四节的时候到北大去对于科技创新希望给予更多的鼓励,我们也特别介绍了目前国家在生殖遗传、生殖健康中所面临的问题,特别是流产和出生缺陷,也希望国家给予更多重视,那我们要开发更多新的方法和基因检查,期望达到的目的是覆盖度还要广、还要准确、价格还要可以接受,同时操作也要更简便。所以这样一个单细胞测序在基因组学的研究上应该是现在在世界上被广泛承认,也已经在临床上应用的。

另外就是对于表观遗传,表观遗传的研究逐渐地能够过渡到单细胞对于生殖遗传去应用的话也是基于单细胞表观遗传测序技术的发展,汤富酬教授做的这个,有了这个技术以后首先是在胎儿的脑细胞,就是流产的胎儿,我们征得了病人的同意做的这样一个人的基因组的研究,同时还有车祸的人捐赠的脑组织,我们做的相关研究,然后对于技术有了进一步的发展,同时国际上其他同道也在不断报道,我们在2013年对于早期胚胎的DNA延展计划图谱做了一个详细的描述,这个图谱描述出来以后,应该说是比较好的勾画出来了一个从配子-精子-卵母细胞,再到胚胎,再到早期的胚胎,我们今年6月份新发表的这一篇文章是对于早期的生殖细胞的一个研究,我们期望的是这样一个基础的研究出来了整个一个人类胚胎发育的表观遗传我们重要的是和未来的联系,就是人类的一些跟表观遗传相关的疾病在胚胎期是怎样的一个影响,同时我们体外受精这样一个技术会不会对表观遗传产生的比如说代谢综合征,我们现在发现成人的代谢综合征是明显增加的,跟环境因素关系很大,但是现在看跟遗传的关系也是比较大的。

而我们辅助生殖技术出生的孩子追踪到现在,因为现在第一例试管婴儿是37岁了,我们中国大陆的第一例试管婴儿是27岁,这个孩子在我们这里工作,也有一点肥胖,那么国际上报道的目前出生的这些孩子里的代谢综合征的发生率是增加的,那么它的这个增加跟遗传肯定是没有关系的,那么跟表观遗传是什么关系?是在胚胎发育的哪个阶段?是体外培养的?还是在孕期,母亲的营养方面?那我们要去研究它可能发生的相关因素,给予阻断,可能会产生更好的一个影响。所以生殖遗传应该说还是一个相对的需要更多其他技术去结合起来、多学科合作、能够探索。首先是人类生殖的奥秘,然后我们才敢说跟临床线下的联系、跟临床疾病的联系,讨论这些可能的机制,再到临床上去做诊断和应用。

本文根据现场发言整理,未经专家本人确认。

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