这项曾与诺奖失之交臂的发现,今年还会继续陪跑么?
2020/09/29
miRNA有哪些独特之处。

miRNA的发现,与一位祖籍波兰的生物学家维克托·安博斯(VictorAmbros)的工作有关——他在线虫中发现了第一个miRNA lin-4。

许多人认为,首次发现miRNA的安博斯同样应该在诺贝尔奖的历史上留下名字。由于诺贝尔奖评选委员会很少会针对同一个领域重复颁奖,所以尽管安博斯曾一度被提名诺贝尔生理或医学奖,却最终失之交臂。

但我们不得不承认,过去的几十年是我们对基因表达和转录后调控理解上的一场革命。

以前,蛋白质的基因组结构和亚型(例如转录因子和表观遗传介体)被认为是基因表达的唯一调节剂。

但是,近年来,参与转录后调控的miRNA和其他ncRNA揭示了对多种细胞功能至关重要的调控机制。

目前,研究人员在理解miRNA的生物发生和功能、编码miRNA的基因结构、靶向miRNA的序列特异性以及miRNA的应用方面取得了长足的进步,人们越来越关注miRNA作为细胞过程的重要调节剂以及在疾病的发生和发展中的作用。

今天我们就一起来探索一下这类小RNA的独特之处。


miRNA的研究历程[1]

1. 动物miRNA的发生

MicroRNA(miRNA)是一类内源编码的〜22个核苷酸的非编码单链RNA,占哺乳动物基因组的2%。

30年前,人们在研究线虫发育过程时发现lin-14mRNA的活性受到一个特殊负调控机制的影响,后来证明此负调控机制是lin-14编码的miRNA片段,能与lin-14mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)不完全互补从而调控lin-14的翻译,从此开启了miRNA研究的新纪元。

miRNA的生物合成来源于RNA聚合酶II和III直接从基因组DNA的不同区域转录长度高达几千bp的初始miRNA转录本(pri-miRNA)。

随后,pri-miRNA由RNAse III酶Drosha和辅助因子DGCR8共同组成的复合体进一步加工以形成茎环或发夹结构前体miRNA(pre-miRNA)。然后转运蛋白Exportin-5(XPO5)、Ran-GTP转运子将pre-miRNA从细胞核转运到细胞质。

在这里,它们被另一种RNAse III酶(dicer酶)剪切成小的双链RNA(dsRNA),其中5’端热力学稳定性最差的一条与TRBP结合并富集Argonaute蛋白(AGO),形成RNA诱导的沉默复合物(RISC),这条链即为成熟miRNA,另一条为互补链。

RISC复合物通过miRNA与mRNA的3'-UTR的靶位点结合来进行翻译抑制和靶向mRNA降解,继而介导基因沉默。另一条互补链本应趋向于降解,但Ro及其同事对小鼠和人的969个miRNA分析时发现了117条互补链,说明可能存在双链miRNA,且不论是成熟体还是互补链都具有组织特异性。


动物miRNA的发生[2]

2. miRNA的调控机制

长期以来,研究人员已经观察到RISC可以在细胞核以及细胞质中介导转录后基因沉默(PTGS),从而影响胚胎发育,调控物质代谢,介导信号传导,参与细胞凋亡、病毒感染以及疾病的发生。

miRNA与其靶mRNA结合的主要决定因素是miRNA 5'端的6-8个核苷酸序列,即“种子”序列。miRNA与种子区域之间的任何序列互补都会触发靶mRNA表达水平的下降。

种子序列匹配可发生在基因的任何区域,但更可能存在于mRNA的3'UTR,根据与3'UTR靶序列同源的程度,miRNA可以诱导mRNA的翻译抑制或降解。鉴于每个miRNA能够调节许多基因的表达,所以每个miRNA可以同时调节多个细胞信号通路。

细胞质中的PTGS是miRNA通过miRISC介导的经典功能。如,miR-139-5p和miR-144能够在mRNA和蛋白质水平上降低TET2和TET3的表达。

PTGS的第一步是识别,基本原则包括规范的Watson-Crick AU、GC配对和非规范的GU配对。在靶mRNA上有一个特殊的miRNA反应元件(MRE),用于miRNA识别和结合。MRE与TET2和TET3 mRNA一样,大多位于mRNA的3'-UTR,但是一些研究表明,它也出现在5'-UTR中,甚至出现在蛋白质编码序列中。

miRNA在细胞核中可以起增强子的作用。增强子是能够上调基因转录的基因组顺式调控元件。在miRNA基因(MIR)中发现了包括H3K27ac在内的一些增强子标记。一些miRNA,如miR-26a-1,miR-339,miR-3179,miR-24-1,miR-24-2,已被证明能够诱导邻近基因的表达。由miRNA诱导的增强子激活需要Ago2直接在基因座处发挥作用或将成熟的miRNA从细胞质带到细胞核。

除了上述miRNA的传统作用机制外,最近还发现了其他“非经典”作用机制。一些证据表明,miRNA可以通过在靶mRNA的AU富集区域募集蛋白质复合物来增加靶mRNA的翻译,或者通过相互作用和调节阻遏蛋白来间接提高靶mRNA的水平。另有证据表明部分miRNA能提高核糖体合成,从而调节蛋白质的合成,或跳过细胞周期停滞,从而激活靶基因抑制。

3. miRNA的生物信息学工具

自从1993年发现第一个miRNA lin-4以来,已经鉴定了271个物种中的48885个成熟miRNA,并将其存放在金标准存储库miRBase中。至今,已经针对miRNA生物发生的每个过程开发了许多生物信息学工具,包括用于miRNA预测发现、结构分析和靶标预测。


miRNA研究的历史时间表以及生物学数据库开发[3]

注释工具是该领域中最重要的工具之一。

每个miRNA序列、pre-miRNA二级结构和miRNA基因位点等都需要一个miRNA数据存储库。miRBase是此领域主要的存储库,收集了所有已知的miRNA序列和所有物种的注释。

Rfam是用于RNA注释的统一系统,包含了miRNA家族信息。miRIAD容纳了miRNA及其宿主基因的信息,mirtronPred从内含子序列预测mirtrons,mirSTP用于识别miRNA转录起始位点(TSS),MetaMirClust提供有关miRNA簇及其保守性的全面信息。

其次,miRNA的二级和三级结构对于特异性结合蛋白的识别或与其他RNA的相互作用非常重要,结构特征和自由能是预测miRNA分子的关键特征。ViennaRNA和RNAstructure是代表性的miRNA结构预测工具。

miRNA的鉴定识别系统也是一个重要工具,MiRscan可用于鉴定线虫中保守的miRNA。miRNAFold是一种 ab initio 用于从基因组中大规模预测miRNA 的快速工。还有基于下一代测序(NGS)数据识别miRNA的工具,如miRDeep和miRanalyzer。

切割位点、结合和靶标发现工具对于miRNA研究也十分重要。

LBSizeCleav和PHDcleav工具可以用来预测pre-miRNA中的Dicer切割位点。miRBShunter、Antar和miRTar2GO可以用来检测来自AGO-CLIP-Seq(例如AGO-PAR-CLIP和AGO-HITS-CLIP)的miRNA结合位点。

还有miRanda,TargetScan,PicTar,RNAhybrid和PITA等也可以用来预测miRNA,研究其功能,miRecords和miRTarBase也是经过验证的miRNA目标数据库。

另外,将miRNA与表型相关联是注释miRNA功能的另一种方法。

HMDD收集了人工治愈的人类疾病相关的miRNA,PASmiR包含用于植物的特定miRNA,CERNA包含miRNA的反应元件(MRE)。

miRNA相互作用网络也是时下流行的研究方向,starBase和PceRBase等数据库记录了特定类型的RNA相互作用(例如,miRNA-lncRNA,miRNA-circRNA和miRNA-mRNA)。

细胞外miRNA是临床应用的潜在生物标志物,专门收集在miRandola和ExoCarta等数据库中。


每个过程中的生物信息学工具[3]

4. miRNA的应用

miRNA是许多生理功能的重要调节剂,在细胞发育、分化和体内平衡过程中形成了复杂的调控网络,其功能的失调与越来越多的人类疾病(尤其是癌症)相关,研究人员希望能用miRNA来开发新的疾病治疗策略。

4.1 miRNA在癌症治疗中的应用

miRNA失调,无论是致癌性miRNA的过表达还是抑癌性miRNA的下调,都可能引起恶性肿瘤。据报道,核miRNA通过作用于相应基因位点的启动子而参与多种肿瘤启动子/阻遏物基因或与癌症相关的基因的转录调控。

使用miRNA来开发新的肿瘤治疗策略主要基于以下两种方法:1)将miRNA用作药物分子,基于特定寡核苷酸的合成和传递,能够增加或降低肿瘤组织中miRNA的水平;2)调节miRNA结合非基于miRNA的药物疗法以提高常规疗法的疗效。

基于miRNA的癌症疗法是一种通过恢复miRNA对抗发病机制的策略。主要采用拮抗剂和模拟寡核苷酸(通常称为“antagomiR”)以抑制在人类疾病中病变的miRNA。

miRNA通过高度特异性的Watson-Crick碱基配对作用,对于高表达的致癌性miRNA,配对碱基可被antagomiR封闭,该寡核苷酸可与miRISCs高亲和力结合从而破坏其抑制功能。对于抑制肿瘤的miRNA,miRNA模拟物可以恢复miRNA的功能。

目前许多制药公司也在开发靶向miRNA和拮抗miRNA疗法,其中最成功的基于antagomiR疗法是针对miR-122的靶向治疗。miR-122在肝脏中高表达,是HCV复制中必不可少的辅助因子。研究人员用与miR-122完全互补的2'-OMe反义RNA处理细胞系消除了HCV复制。

由Santaris Pharma和Hoffman-La Roche开发的Miravirsen基于miR-122的疗法已经进入临床试验,并且在非人类灵长类动物中具有良好的耐受性,大大降低了HCV负担,很可能成为第一个基于miRNA的治疗药物进入市场。

miR-21的过表达与几种类型的癌症发病机理有关,其体外抑制实验导致胶质母细胞瘤、乳腺癌和肝癌细胞死亡。Regulus Pharmaceuticals已开始研究抗miR-21用于肝癌和Alport综合征的研究,并已经开始了肝癌治疗的临床前试验。

4.2 miRNAs作为诊断和判断预后的生物标志物

在临床医学检测中,我们经常对生物标志物进行测量以帮助诊断,此标志物应具有特异性、敏感性、无创性、在流行病学组之间保持一致、易于量化且具有成本效益的特点,重要的生物标志物也应随疾病或治疗的进展而改变,以便于监测。

由于miRNA可由实体瘤分泌到周围环境中并且在体液中稳定存在,能在血浆、唾液、牛奶和脑脊液等体液中检测到,且易于通过微阵列、NGS和定量PCR进行检测,所以是生物标志物的理想候选者。

MiR-21是研究最多的癌基因miRNA标志物之一,在几乎所有人类癌症中都检测到过表达,它负调节肿瘤抑制基因PTEN以及促凋亡蛋白BAX的表达。因此,miR-21的过表达与肿瘤侵袭性相关,同时抑制细胞凋亡。

在淋巴瘤(DLBCL)患者的血清样本中miR-21、miR-155和miR-210表达上调。在乳腺癌(BC)患者血液中miR-195、miR-29a、miR-21、miR-16、miR-25、miR-222和miR-324-3p表达升高。miR-155在B细胞成熟中起作用,在B细胞和血浆中检测到miR-155升高可诊断为B-CLL。

AML患者血清中的miR-150和miR-342含量较高,且在完全缓解的AML患者中,miR-150和miR-342恢复到正常水平,表明这两种miRNA可以成为监测治疗效果的生物标志物。

除了用于疾病的预测外,miRNA还可作为药物治疗的预测生物标志物。miRNA的表达受药物影响,而且本身也可能影响药物的代谢和毒性,因此miRNA的表达也可用作药物功效的潜在生物标记,特别是循环miRNA,例如,miR-21的高表达和miR-200b的表达下调与对多种化疗药物的耐药性有关,可以作为患者对化疗反应的预测性替代生物标志物。

4.3 microRNAs用于药物功效和药物安全性评估

药物引起的肝损伤、心脏毒性和肾毒性是药物开发过程中的主要问题。由于miRNA参与了不同器官在药物诱导的毒性中的作用(例如肝脏、心脏、肾脏、肌肉、中枢神经系统和生殖器官等),因此可以利用miRNA评估药物安全性。

目前检测患者药物性肝损伤的临床实践标准是测量血液样本中的生物标志物水平,如ALT、AST 、ALP和胆红素,然而,这些生物标志物敏感性和特异性低,不能进行早期诊断。

在器官损伤期间,miRNA通常会释放到生物流体中且稳定存在,因此,在血液或尿中的miRNA可被作为非侵入性生物标记物用于检测肝脏疾病和毒性,且检测方法简单、经济、高效。目前,已经鉴定出指示肝损伤的肝特异性miRNA,如miR-122。

在药物心脏毒性的预测中,最广泛使用的血清蛋白生物标志物cTnI和cTnT只在组织损伤已经发生3-12小时内升高,敏感性低,不适合快速测定。

研究人员在使用啮齿动物进行的急性心脏毒性研究和人类心肌损伤的研究中,已经在血液中检测到了心肌特异性miRNA,这些miRNA用作心脏毒性的相对无创性循环预测指标在药物安全性评估中具有巨大潜力,尤其是在临床前模型中。

总尿蛋白、葡萄糖N-乙酰基-β-(D)-氨基葡萄糖苷酶、血清肌酐和尿素氮(BUN)已被用作肾毒性的生物标志物,这些标志物的升高通常与已确定的肾损伤有关,不能进行早期快速的检测,Blatt 等人报道了使用miRNA检测顺铂的肾毒性,表明miRNA在肾脏损伤的发病机理中起作用,并且可以充当肾毒性的生物标志物。


miRNA调节药物疗效和安全性[4]

自从1993年发现miRNA以来,人们不断深入探索此领域,了解了它们在基因组中的编码方式、转录方式和加工方式以及抑制蛋白质翻译的机制,逐渐认识到这些转录后调节因子在生理调控中的重要性,同时也意识到这些小RNA作为疾病诊断治疗的巨大潜力。

但目前我们对miRNA的了解尚浅,基于miRNA的治疗与诊断还有很长的路要走,基于miRNA的疗法的主要问题是如何组织特异性递送,为了避免miRNA的快速降解和排泄,开发出可以增强稳定性和靶向组织的新递送系统也极为重要。

总之,miRNA为疾病的诊断治疗提供了崭新的平台和思路,将成为精准医疗领域的后起之秀。

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