人线粒体转录终止因子3在原核系统和胃癌组织中的表达
生物探索 · 2018/09/30
人线粒体转录终止因子3( hMTERF3),是人类MTERF蛋白家族的重要成员,可以在大肠埃希菌中原核表达MTERF3蛋白,不少医药研发公司提供原核表达服务。原核表达是将动、植物的目标靶基因片段连接至合适的原核表达载体中,并转化进入原核细胞

人线粒体转录终止因子3( hMTERF3),是人类MTERF蛋白家族的重要成员,可以在大肠埃希菌中原核表达MTERF3蛋白,不少医药研发公司提供原核表达服务。原核表达是将动、植物的目标靶基因片段连接至合适的原核表达载体中,并转化进入原核细胞,随后利用细菌自身的蛋白质表达系统进行目标蛋白质的重组表达。研究表明hMTERF3可能参与胃癌的发生,进行hMTERF3 mRNA和蛋白质在胃癌组织及正常组织中的表达,可以探讨其与胃癌发生、发展的关系。

MTERF3这一因子主要抑制mtDNA的表达,通过减少呼吸酶的产生而降低细胞能量的合成,关于MTERF3的研究可以为糖尿病、心脏病、帕金森等疾病的治疗开辟新思路。原核生物表达系统主要包括大肠杆菌表达系统、芽胞杆菌表达系统等,最常用的是大肠杆菌表达系统,因为操作简单、成本低、基因背景清楚,目的蛋白表达量高。美迪西提供原核表达服务,其科研人员建立了成熟的大肠杆菌表达及纯化服务平台,提供包括各种重组蛋白以及其复合物在大肠杆菌中的表达与纯化服务。

为了进一步研究MTERF3蛋白在体内外的功能,构建人MTERF3基因的原核表达载体,获得高质量的抗体是前体条件。

在原核表达载体上表达人线粒体转录终止因子3

大肠埃希菌是人体内的一种正常菌群,不但不致病,而且对人体起着保护作用,比如它合成维生素B6和维生素B12,供应细菌自身及人体的需求;它还抑制肠道致病菌的生长繁殖,还可以促进机体免疫系统发育成熟。但也有几种类型的大肠杆菌可以引起机体发生特异性的腹泻,如大肠埃希氏菌在人和动物的粪便中大量存在,其中有少数几种能引起人类食物中毒。

RT-PCR扩增人MTERF3基因cDNA的完整开放阅读框,克隆至原核表达载体pET28b,转化大肠埃希菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导6×his融合蛋白质表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组人MTERF3蛋白。以纯化的重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性多克隆抗体,用ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测抗体的效价和特异性。

后来成功在大肠埃希菌细胞中原核表达重组人MTERF3蛋白,并获得高质量的鼠抗人MTERF3多克隆抗体。ELISA结果显示抗体的效价为1∶105,Westernblot和免疫荧光结果显示鼠抗人MTERF3能特异性识别天然的MTERF3抗原。因此原核表达的重组人MTERF3蛋白具有良好的免疫原性,其免疫小鼠后获得的多克隆抗体具有高效价和高度的特异性。人MTERF3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备为进一步研究人MTERF3的功能奠定了实验基础。

2、hMTERF3与胃癌的关系

为了分析hMTERF3mRNA和蛋白质在胃癌组织及正常组织中的表达,探讨其与胃癌发生、发展的关系。分别采用半定量RT-PCR和免疫组化SP法,检测61例胃癌组织及正常组织中hMTERF3mRNA和蛋白质表达水平,分析hMTERF3表达与胃癌临床分期、病理分级、肌层浸润和淋巴结转移的关系。

结果发现,hMTERF3mRNA和蛋白质在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃组织,hMTERF3蛋白在正常胃组织阳性率为24.6%(15/61),胃癌组织中的阳性率为86.9%(53/61),差异具有统计学意义。hMTERF3蛋白的表达与胃癌临床分期、病理分级、肌层浸润和淋巴结转移有关。因此hMTERF3蛋白的表达异常可能是胃癌发生、发展的分子机制之一,可为预测胃癌的发生提供可能的生物学标志物,也可为胃癌基因诊断和基因治疗提供潜在的靶标。 


查看更多
发表评论 我在frontend\modules\comment\widgets\views\文件夹下面 test