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全外显子组测序常见问题(下)

2018/09/29 来源:生物探索
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导读
11外显子捕获效率是什么?外显子测序过程中要用到杂交过程。在人的染色体上有许多与外显子有同源性的部分,这些有同源性的部分很可能在杂交过程中也被捕获下来。所以,测到的序列中,有一部分不是外显子序列。我们把测序得是外显子的部分占全部测序序列的比

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外显子捕获效率是什么?

外显子测序过程中要用到杂交过程。在人的染色体上有许多与外显子有同源性的部分,这些有同源性的部分很可能在杂交过程中也被捕获下来。所以,测到的序列中,有一部分不是外显子序列。我们把测序得是外显子的部分占全部测序序列的比列称为捕获效率。捕获效率的高低不影响数据质量,只影响数据的有效比例。

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何时选择全外显子捕获?何时选择定制探针捕获?

人类和一些常见物种的全外显子捕获都有预设的探针产品,其中人类全外显子探针已优化过多个版本。如果目标区域很多且均为外显子(几十Mb以上),建议直接选择全外显子捕获,因为全外显子有设计更成熟的探针组和更低的成本,捕获效果更好。对于较小的目的片段,或者也关注外显子以外的区段,建议采用定制探针。

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定制设计外显子捕获探针需要提供什么信息?

物种、参考基因组信息、目标区域信息(坐标、基因名字或基因编号等),由欧易技术人员完成设计。如只提供坐标信息,应使用表格的形式提供。如提供基因名字,最好是NCBI 的正式名称,有对应的基因编号。提供的多个目标区域允许重叠,不影响后续的设计和分析。在设计完成后会将最终的区域信息反馈给客户确认,目标区域最大支持200Mb(合并计算后)。提供基因名字后,欧易技术人员可以帮客户找到基因的特定区域,如外显子、UTR 等。如果要求捕获其中的几类或者全部,需要注明。

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常规物种、物种基因组较新、不完善或者错误较多能不能做外显子捕获测序?

可以,捕获测序平台没有种属限制,只需要提供基因组序列信息以及目标区域信息即可。即使物种的参考基因组比较新、不够准确的、甚至是差别非常大,也可以进行捕获测序设计。但相应地,捕获的探针是根据客户提供的序列来设计的,因此不能完全保证结果的准确性。

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降解样本是否能开展后期建库?对于后续数据及分析有哪些影响?

样本降解非常严重,不建议风险建库,建库成功率低; 样本严重降解若构建人外显子文库的影响主要是捕获效率会偏低,有效数据量偏低,properly mapped偏低。

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样品粘稠、胶孔杂质污染及RNA污染对建库有何影响?建库成功率大概是多少?

轻微的蛋白污染对建库影响较小,但是如果蛋白戒其他杂质污染严重,一是会影响定量,二是会影响建库中酶效率,使建库成功率降低; RNA污染主要影响样本定量及建库中DNA的分选;所以存在RNA污染,在样本总量及质量合适情况下建议进行RNA消化;

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一块组织能够进行DNA和RNA共提取吗?提取方法是什么?

可以进行共提取;共提取方法一般有两种,一种是将组织切割分为两部分,各进行DNA和RNA的提取;另一种为使用DNA/RNA共提取试剂盒提取,但是一般提取后特别容易造成DNA及RNA 的降解。

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FFPE样品DNA提取得率低的原因是什么?

FFPE样品一般为存放多年的样本,本身已经由于甲醛作用降解严重;且FFPE样本一般比较珍贵,老师送样量较少。

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cfDNA与ctDNA的区别何在?

cfDNA(cell free DNA)是在血液中游离的DNA,是身体正常细胞戒者白血球破裂释放出来的,对身体无害,不久便会被自身清理; ctDNA为(circulating tumor DNA): 是肿瘤细胞破裂释放到血液中的游离DNA,可作为一种高特异性的肿瘤标志物。

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提取cf/ctDNA时血浆样本分离方法?

采集外周血5 mL(采血时间一般为早晨或上午),迅速转入EDTA抗凝管中,小心颠倒混匀(防止溶血);在1小时(室温条件下)或2小时(4℃条件下)内分离血浆:4℃, 1000 rpm离心10分钟,小心吸取血浆转至洁净的1.5mL EP管中(吸取血浆过程中注意不要吸到白细胞),然后12,000rpm,4℃离心10分钟,去除残余的细胞或碎片,小心吸取所需上清体积到新的分装EP管中,用油性marker笔标记,放入-80℃超低冰箱中保存,避免反复冻融,干冰运输送样。

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本文系欧易生物原创

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