浅析大规模酵母双杂交技术的发展基础
生物探索 · 2018/09/29
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,可以研究活细胞内蛋白质的相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间作用也能够通过报告基因的表达产物检测得到。酵母双杂交文库构建是筛库的前提,可用于目的蛋白的互作蛋白大规模筛选分析蛋白质间的相互作用,是现在

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,可以研究活细胞内蛋白质的相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间作用也能够通过报告基因的表达产物检测得到。酵母双杂交文库构建是筛库的前提,可用于目的蛋白的互作蛋白大规模筛选分析蛋白质间的相互作用,是现在分子生物学与生物化学常用的手段。

几乎所有的重要生命活动,包括DNA的复制和转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等都离不开蛋白质之间的相互作用。酵母双杂交技术是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大规模双杂交技术的发展与许多因素有关,其中一些技术的发展和应用为酵母双杂交技术向大规模、自动化方向发展打下了基础。美迪西提供酵母双杂交服务,具有独立优质实验室,专业实验人员,提供详细的酵母双杂交实验步骤、原始数据和图片、结果分析,可以出具权威检测数据报告。

1、表达文库构建技术

表达文库构建技术出现较酵母双杂交技术早,到酵母双杂交技术出现时表达文库构建技术已基本成熟,因此把表达文库应用于酵母双杂交筛选蛋白质相互作用得到了研究——(单个诱饵对猎物cDNA基因组文库)对猎物文库(cDNA文库/基因组文库)筛选蛋白相互作用, 结果大大提高了相互作用蛋白的筛选效率和规模,促进了酵母双杂交技术研究蛋白质相互作用向大规模方向发展。

采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料进行酵母双杂交文库构建,能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质,适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。

2、Gateway克隆技术

Gateway克隆技术是利用λ噬菌体DNA自然条件下可与其宿主大肠杆菌DNA发生位点特异性重组整合和可逆切割分离这一机制并加以改进创建的。相对酶切构建载体来说,该技术具有需时短、操作简单、易于各实验室交流的特点,即只需通过简单、高效的BP和LR反应就可实现把PCR产物定向转入克隆质粒和表达质粒,实现PCR产物在各种质粒间的转移。另外这一技术得到了一些大生物公司的重视,不但有各种构建好的质粒载体出售,还有利用该技术建好的各种全长ORF克隆、全长cDNA文库等供选购,直接购买应用可简化准备工作。

3、PCR技术和测序技术

PCR技术和测序技术已经实现大规模和自动化,因此使诱饵对文库的筛选或文库对文库的筛选的阳性克隆测序和鉴定变得容易、快速;另外两项技术的发展使全基因组测序成为现实,产生了许多物种的基因组序列及预测的ORF,因此,使人们对一种生物的所有预测ORF所编码蛋白进行大规模相互作用研究成为可能。

4、酵母交配技术

酵母单倍体菌株有两种相反的交配型,可交配形成二倍体酵母,因此可把DBD-X转化入一种单倍体,AD-Y转化入另一种单倍体,然后把分别含DBD-X、AD-Y的两种单倍体共接种到液体培养基培养、交配后再接种到二缺板上培养。这样只有含DBD-X和AD-Y的二倍体菌株生长,然后作表型鉴定判断X、Y有无相互作用。显而易见,这个过程相对顺序转化或共转化来说,不但显得简单、高效,而且易于大规模和自动化。另外适合阵列筛选的配套仪器已经出现,使大规模酵母双杂交技术变成现实。

酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用,及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:

(1)作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

(2)检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。

(3)检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

(4) 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

 


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