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全外显子组测序常见问题(上)

2018/09/28 来源:生物探索
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导读
1全外显子组测序必须要有参考基因组吗?必须有,如果没有参考因组,要提供近缘物种的序列,但不能保证捕获结果的可靠性。因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的,如果已知目标区域与参考基因组比有较大出入,例如大片段的插入缺失,是不推荐的。2为什么

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全外显子组测序必须要有参考基因组吗?

必须有,如果没有参考因组,要提供近缘物种的序列,但不能保证捕获结果的可靠性。因为捕获探针是根据提供的参考序列来设计的,如果已知目标区域与参考基因组比有较大出入,例如大片段的插入缺失,是不推荐的。

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为什么外显子测序在分析时需要跟全基因组比对,而不是直接与目标区域比对?

第一,目标区域相对于全基因组一般较短,而且可能不连续,如果将目标区域单独提取出来,会影响区域边缘的序列比对效果;

第二,无法评估捕获质量,例如脱靶率、on target比例等。

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全外显子组测序一般建议做多少倍的覆盖?

一般做100×或150×。较高的覆盖倍数,对于测异质性的遗传变质,可以发现小比例的突变。另外,外显子测序的覆盖是随机的,这样较高的平均覆盖率有利于保证大部分的区域有足够的覆盖倍数。

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全外显子组测序深度的意义是什么?测序深度如何换算?

测序深度代表了序列被探针组覆盖的次数,次数越高,测序结果的识别就越精确,后续的统计分析也就越准确。如果做肿瘤、低频突变研究,建议测序深度至少应达到150×以上。如果只看经典SNP、非低频突变,测序深度也至少应该在30×以上。测序深度换算方法:一般目标区域的捕获效率在60-70%,安捷伦和罗氏等外显子捕获试剂盒的目标区域大小在60Mb左右,即测序深度=10G*60%/60Mb=100×。

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全外显子组测序能够测出多大的片段缺失?

大致能测出50bp的片段缺失。由于外显子测序的覆盖很不平均,所以如果有大段的缺失,无法判断是因为杂交没有捕获到,还是因为缺失。目前能够测到的,就是在一个read中发现的缺失。一个read的长度也就是150bp,所以50bp以下的片段缺失可以从外显子测序中测出来。

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全外显子组测序可以做CNV分析吗?检测CNV的方法还有哪些?

全外显子测序因为有一个杂交捕获的过程,这样就会有一个杂交捕获效率的问题。各个外显子的杂交效率是不同的,其同源竞争的情况也不同,所以不同的外显子的覆盖率的差异就很大。所以一般情况下,外显子测序不能用于CNV的检测。但在癌症研究中,利用癌组织和癌旁组织对照,可以检测CNV。还有另外两种常规方法来检测CNV,一种是全基因组重测序,另外一种是用Affymetrix SNP6.0的芯片来测。其中Affymetrix SNP6.0的检测费用较低,是一个相对经济的手段。

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全外显子组测序能否进行目标区域甲基化检测?可以进行RNA捕获吗?

目标区域甲基化检测可以直接使用甲基化捕获测序产品,例如SureSelect的MethylSeq或者NimbleGen的SeqCap Epi,都能进行甲基化捕获,原理和捕获测序类似,利用特制的探针对研究者感兴趣的目标区域进行捕获富集,经过亚硫酸氢盐处理后进行测序和甲基化检测。RNA捕获可以使用SureSelect的RNA Capture或者NimbleGen的SeqCapRNA System产品。

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能否捕获多物种混合的样品?

可以,只要捕获的目的片段有相应的参考基因组,就能够被探针捕获到。例如宿主基因组中整合的病毒序列、血液中混合的寄生虫序列、环境样品中的低丰度微生物序列等等。由于这些序列在混样中所占的比例往往很低,使用传统的重测序方法的效率会非常低,需要非常高的测序量才能得到足够的覆盖深度,同时会产生大量的冗余数据。捕获测序在这方面具有绝对的优势。

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捕获的效果有没有指标?什么因素会降低捕获效果?

由于测序技术的限制,会有部分重复序列、未确定的“N碱基”、样本本身质量等因素导致序列有无法覆盖到的可能性,这是所有测序技术都会遇到的问题,即使是全基因组深度测序,也无法保证100%完全覆盖基因组。由于每位老师的样品千差万别,对捕获的效果直接做出承诺并不靠谱。最好的方式是:老师提供给我们目标区域,由欧易技术人员设计评估一下,就能得出预期的覆盖度、可能无法覆盖的区域等详细报告。此外,物种普遍存在重复序列的情况,在设计前一般会先屏蔽掉一些难以覆盖的重复区域(mask)再进行设计,会提高捕获质量,但同时会降低总体的覆盖度。

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高GC 含量的片段能否捕获?

可以,但对这些片段的捕获效率会有一定影响。同样地,低复杂度片段和含有模糊碱基片段也有一定的捕获难度。欧易技术人员在设计探针时会根据覆盖度情况适当增加覆盖次数和探针密度等,并且将预期的捕获效果(能够捕获到的片段、无法捕获到的片段)发给客户确认。另外,如果是捕获全外显子、UTR 等,可以选用预设探针组,这些探针设计对较难捕获的片段进行了优化,提高了相应的捕获效率。

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本文系欧易生物原创

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