项目文章 | 欧易生物免疫组库测序技术助力肝再生机制研究
生物探索 · 2018/09/26
前言今天,小编为大家分享的文章,是由欧易生物与免疫组库研究专家团队经过密切合作,通过高通量测序技术及利用生物信息学方法对高通量测序后的大数据进行分析,成功总结出的疾病模型下免疫组学核心算法。相关研究成果已发表在Hepatology(IF=1

前言

今天,小编为大家分享的文章,是由欧易生物与免疫组库研究专家团队经过密切合作,通过高通量测序技术及利用生物信息学方法对高通量测序后的大数据进行分析,成功总结出的疾病模型下免疫组学核心算法。

相关研究成果已发表在Hepatology(IF=14.079)等高影响因子杂志。


基本信息

英文标题:Intrahepatic T cell receptor β immune repertoire is essential for liver regeneration

中文标题:肝内T细胞受体β免疫组库对肝再生是必需的

发表期刊:Hepatology

发表时间:2018.04

影响因子:14.079

研究目的:TCRβ免疫在肝再生中的作用

研究样本:C57BL/6(野生型小鼠4例),Tcrb-/-(TCRβ 链缺失的部分肝切除小鼠4例), TcrbAD-Cre(通过Cre重组得到的TCRβ链缺失的部分肝切除小鼠4例)

研究技术:TCR β测序,免疫组化,免疫荧光,WB,RT-qPCR,流式细胞,细胞因子检测


研究结果

1. TCRβ缺失导致肝再生受损

免疫组化分析证明TCRβ链在Tcrb-/-和TcrbAD-Cre小鼠中缺失。这两种TCRβ链缺失小鼠在接受部分肝切除术后,其肝脏在外观、大小、重量上和野生小鼠的没有明显差异,但是血清转氨酶水平(肝损伤指数)、空泡样变性肝细胞、肝-体比重等明显降低(Fig. 1A-D)。此外,相比于野生小鼠,Tcrb-/-和TcrbAD-Cre小鼠的肝细胞增值急剧减少(Fig. 1G, H),肝细胞凋亡提高(Fig. 1E, F)。这些数据表明TCRβ对肝细胞增殖和肝再生是必不可少的。

Fig 1. TCRβ对肝再生是必须的

 

2. 肝切除后TCRβ缺失引发异常的炎症环境

TCRβ缺失急剧降低炎症因子的表达,包括炎症信号通路p-STAT3(Fig. 2A, B)、以及细胞因子IL-6、IL-4、TNF-α(Fig. 2C)在Tcrb-/-和TcrbAD-Cre小鼠中的表达量明显低于野生小鼠,IL-17在Tcrb-/-中的表达量升高了(Fig. 2C),IFN-γ和IL-22没有明显变化(Fig. 2C)。上述结果表明TCRβ缺失引起了肝内异常的炎症反应,从而影响了肝再生过程。

 Fig 2. 肝再生过程TCRβ缺失削弱炎症激活反应

 

3. 体外实验表明肝内免疫微环境调控肝细胞增殖

将小鼠永生花肝细胞系(NCTC1469)和从野生小鼠肝脏切除前后分离的肝内免疫细胞(或αβ T细胞)进行共培养,结果发现,肝脏再生前后αβ T细胞对肝细胞增殖活性没有影响。相反,从肝切除Tcrb-/-小鼠分离的免疫细胞与小鼠正常肝细胞(NCTC1469)共培养后,肝细胞增值和Ki67表达明显降低(Fig. 3A-D);而且肝细胞凋亡加剧(Fig. 3E, F)。Western blot结果进一步发现,细胞周期蛋白D1和p-STAT3的表达水平降低,caspase3的表达水平升高(Fig. 3G, H)。这些结果表明肝细胞增殖和凋亡是受肝内免疫微环境的调控,而不只是αβ T细胞的调控。

Fig 3. 肝内免疫微环境调控肝细胞增殖和凋亡(体外实验)

 

4. TCRβ影响免疫细胞的激活

作者进一步研究TCRβ缺失是不是通过影响相关免疫亚群的富集和激活而影响肝再生。Tcrb-/-小鼠在肝再生过程中T细胞总数急剧减少,其中αβ T细胞的变化可忽略,但是γδ T细胞的数量显著上升(Fig. 4A-C)。其他免疫细胞亚群(如NK/NKT和 Kupffer细胞)没有显著变化。那么,肝切除后免疫细胞亚群有何变化呢?γδ T细胞分泌的IL-17和IL-22在Tcrb-/-小鼠的表达量高于野生小鼠(Fig. 4D, E),活化的部分NK和NKT细胞(CD69+, NK1.1+)在Tcrb-/-小鼠的表达量高于野生小鼠(Fig. 4F, G),Kupffer细胞分泌的IL-6和TNF-α的表达量反而下降(Fig. 4H, I)。上述结果表明TCRβ缺失会选择性激活NK、NKT和Kupffer细胞,减少稳定型NKT细胞,导致肝再生过程中γδ T细胞扩增,显著削弱肝内免疫细胞的活化。

Fig 4. 肝再生过程TCRβ缺失引发异常的免疫微环境

 

5. 肝再生过程中Vβ和Jβ基因解析

肝内αβ T细胞在野生小鼠肝切除后急剧增加(Fig. 5 A, B),对肝切除前和切除6h后的肝内淋巴细胞进行TCRβ测序,共鉴定到23个不同的V基因和13个不同的J基因。频率最高的V基因是TRBV13-2(肝切除前后分别是17.82%和20.76%)和TRBV1(肝切除前后分别是17.67%和20.43%),频率最高的J基因是TRBJ2-7(肝切除前后分别是24.60%和22.79%)和TRBJ2-5(肝切除前后分别是14.52%和12.84%)(Fig. 5 C)。

Fig 5. 肝切除前、后(6h)V基因和J基因分布和丰度


V 基因和J基因的使用频率在肝切除前后比较类似(Fig. 5 D, E),但是某些V基因在肝切除后发生了显著变化,包括TRBV1、TRBV13-2、TRBV12-2、TRBV3和TRBV5(Fig. 5F)。V-J对在肝切除前后没有显著差异(Fig. 6A, B),只有16个V-J对(5.51%)在肝切除前后有显著变化(Fig. 6C, D)。

Fig 6. 肝切除前、后(6h)V-J对的分布和丰度


6. 肝切除导致CDR3氨基酸多样性偏低

CDR3氨基酸克隆型直接决定TCRβ的多样性,本研究在肝切除前后共获得418,944种CDR3氨基酸克隆型。长度为14个氨基酸的CDR3在肝切除后的使用频率高于肝切除前(Fig. 7A)。虽然总的CDR3氨基酸克隆型在肝切除前后比较类似,但是肝切除后高频CDR3氨基酸克隆型(阈值>0.008%, P<0.05)(Fig. 7B, C)和独有的CDR3氨基酸克隆型比例明显减少(Fig. 7D)。基尼系数、香农指数、Rank-abundance分析都表明肝切除后CDR3氨基酸多样性降低(Fig. 7E-G)。上述结果表明肝切除后几个关键的高频CDR3氨基酸的使用频率了发生变化,而且TCRβ免疫组库多样性降低。

Fig 7. 肝再生过程CDR3氨基酸克隆型分析

 

小结

基于高度异常的炎症微环境和免疫微环境,在肝再生过程中,适应性免疫像是“指挥官”而不是“执行者”。同时,除了免疫状态,不能排除还存在TCRβ调控肝再生的其他机制。因此,需要进一步研究其他可能的调控机制,以及TCRβ在肝再生过程如何和其他免疫细胞合作。

Fig 8. 肝再生过程αβ T细胞通过TCRβ重排调控免疫微环境


文章亮点

第一次展示肝再生过程中TCRβ免疫组库的多样化和弱化的免疫状态,该结果至少部分说明TCRβ缺失导致肝再生发生缺陷。

 

参考文献

Qing Liang, Zeyuan Liu, Chao Zhu, et al. Intrahepatic T cell receptor β immune repertoire is essential for liver regeneration. Hepatology. 2018. doi: 10.1002/hep.30067


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Lisa  撰文

本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物


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