基于细胞毒性的抗体类生物治疗药物活性测试方法
生物探索 · 2018/09/18
抗体类药物是指含有抗体基因片段的蛋白药物,它与靶抗原结合的特异性、安全性和有效性等特点,使其在临床上的一些重大疾病中取得了快速的发展。在研究抗体药物如何影响人体之前,需要先考察药物对细胞内部的影响,基于细胞毒性的抗体类生物治疗药物活性测试方

抗体类药物是指含有抗体基因片段的蛋白药物,它与靶抗原结合的特异性、安全性和有效性等特点,使其在临床上的一些重大疾病中取得了快速的发展。在研究抗体药物如何影响人体之前,需要先考察药物对细胞内部的影响,基于细胞毒性的抗体类生物治疗药物活性测试方法,为抗体药物的研发和质量控制提供了方向。

生物技术药物活性测试在质量控制中至关重要,目前的生物活性分析方法主要包括体内(动物)和体外(细胞)实验。上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验,通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等,提供一套完整的生物学服务。

药品质量应该在基于对药物分子生物学特性、作用机制全面了解的前提下,设计开发相应的生产工艺,以求药物分子达到其预期的质量属性。虽然生产过程结束后的产品质量分析是药品质量控制中的重要组成部分,但这些检测不应是单纯的揭示其生产过程的结果,而是对药品的预期属性进行确认。药物分子进入到细胞内,结合细胞内的靶点,从而产生药理作用。在药物研究中,靶标暴露不足是导致药物高损耗的主要原因。假设细胞靶点暴露不足会导致较低的“药物效率”。靶点暴露不足导致药物实验中的高消耗率,是临床药物开发失败的重要因素。

细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件,不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测,比如通过药物活性测试来进行筛选药物。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测,常用MTT、XTT法,利用线粒体内部酶的活性,可以将特定的四唑盐类进行转化,然后通过酶标仪进行检测。

细胞凋亡有两条途径,一是线粒体依赖途径,另一个为死亡受体介导途径。肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α)和受体结合后,可启动死亡受体介导途径,使procaspe-8自我水解、活化,形成活性caspase-8,后者再激活caspase3、6、7等,引起下面的级联反应,导致细胞发生凋亡。重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的活性测定可以利用其能够抑制TNF-α所引起的敏感细胞系U-937中caspase3/7活化。

1、通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性,进行抗体类生物治疗药物活性测试

LDH(乳酸脱氢酶)是一种稳定的蛋白质,存在于正常细胞的胞质中,一旦细胞膜受损,LDH即被释放到细胞外; LDH催化乳酸形成丙酮酸盐,和INT(四唑盐类)反应形成紫色的结晶物质,可通过500nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性,可判断细胞受损的程度。

2、通过萤光素酶发光信号的改变来进行药物活性测试

通过Caspase-Glo3/7检测试剂盒中萤光素酶发光信号的改变来反映该制品的活性。此外,针对TNF-α的单抗还可以采用对TNF-α杀伤敏感的细胞系,如小鼠成纤维细胞L929、小鼠纤维肉瘤细胞WEHI164等,抗体能够抑制TNF-α所诱导的细胞凋亡作用,通过检测细胞存活的染色来评价抗体的生物学活性。在细胞存活相关染料的选择上,包括结晶紫、MTT、MTS、CCK-8等在内的染料具有各自的优缺点。

3、其它酶方法
(1)结晶紫

结晶紫是一种三苯甲烷类染料,常用作生物染色剂和无机离子的显色剂。其染色过程虽然相对简单,但是不能区分死活细胞,只能反映细胞数量。

(2)MTT

而MTT作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水不溶性的橙黄色甲臜产物并沉积在细胞中,而死细胞无此功能,因此可间接反映活细胞数量,但MTT还原产物不溶于水,需被溶解后才能检测。

(3)MTS

MTS还原产物是水溶性的甲臜,无需洗涤和溶解步骤,使用更方便,重复性优于MTT。而CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,溶液相当稳定,对细胞没有毒性,可长时间孵育,是用于测定细胞毒性或细胞增殖试验中活细胞数目的一种简便快速、灵敏度高、重复性好的染料。

随着生物技术的不断进步、人类后基因组学和代谢组学的到来,越来越多的新靶点被发现和研究,扩大了抗体所针对的抗原范围,也必将扩大抗体药物的市场。也会有越来越多的新型技术用于单抗药物活性测试,以实现对抗体药物进行精准、多方位、动态的分析,为抗体药物的质量提供了新的保障。

 


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