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Nature最新成果!规避CRISPR的“脱靶效应”,关键在引导RNA

2018/09/17 来源:生物探索
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导读
作为最受关注的基因编辑神器,CRISPR技术的临床价值一直有待落实。但是,这一颠覆性技术的“脱靶效应”一直是阻碍其应用的关键障碍之一。近日,科学家们找到了一种预测CRISPR准确性的方法,能够有效限制其错误编辑。


© ISTOCK.COM/KMLMTZ66; © ISTOCK.COM/MACROVECTOR

CRISPR-Cas9基因编辑技术的有效运行依赖于Cas9酶在特定目标位点切割DNA。但是,这一技术却面临着“脱靶”的风险,即Cas9酶可能会在错误的位置剪切。我们都知道,编辑了“预想之外”的基因,很有可能会带来不可预控的严重后果。

通常,我们检测非靶标突变(off-target mutations)的方法是:先利用计算机算法预测出最可能被“错误击中”的区域,然后再检查这些“危险区域”的缺失和插入情况。

9月12日,《Nature》期刊最新发表一篇题为“In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations”的研究,揭示了一种预测基因组编辑中“错误突变”的新策略,并在小鼠试验中证实精心设计的引导RNA链不会产生任何可检测到的错误突变。


https://doi.org/10.1038/s41586-018-0500-9

“脱靶效应”有多严重

非靶向剪切可能发生在对生物功能没有影响的基因组位置,也可能会破坏细胞的基本功能。通常,研究人员会利用计算机程序进行预测,但是这些预测依赖于引导RNA如何与DNA结合以及Cas9如何切割的假设。

2017年5月,《Nature Methods》期刊曾发表一篇文章,揭示CRISPR能够引入数百种意想不到的突变。他们发现,CRISPR确实能够成功纠正引发失明的基因,但两只接受了基因治疗的小鼠的基因组中存在超过1500个单核苷酸突变以及超过100处更大片段的缺失和插入。需要强调的是,这些DNA突变都没有被计算机算法预测出来。

虽然错误概率远超我们的认知,但是我们依然缺乏一种能够准确预测CRISPR非靶标编辑的方法,这意味着,目前我们还不清楚这些预测突变是否会发生以及发生的频率如何。

最新研究:引导RNA 是关键

文章作者、瑞典阿斯利康公司的生物学家Marcello Maresca表示,公司的一个长期目标是能够使用基因编辑技术治疗一些人类疾病。“然而,要想实现CRISPR药物的潜力,就需要开发出一种方法,能够让目标基因得到有效修饰,且基因组其他位置不受影响。”

在这项新研究中,Maresca团队与哈佛大学和麻省总医院的生物学家、病理学家J. Keith Joung课题组合作,开发了一种“体内非靶点验证”的方法(verification of in vivo off-targets,VIVO),可以稳定地鉴定出CRISPR在体内全基因组中的脱靶效应。

首先,他们以小鼠基因组为研究对象,在体外将其DNA剪切成片段,每个片段约包含300个碱基对,然后连接一系列使DNA形成闭环的“接口”(adapters)。随后,他们引入一个Cas9核酸酶和引导RNA复合体,它们会在环状DNA的一些位点上进行切割,使其线性化。最后,研究人员会添加另一批核酸酶,负责降解剩余未被剪切的闭环DNA。

通过这一系列步骤,研究人员可以对线性化的DNA进行测序,以检测Cas9在哪些位置进行了切割(无论是有意的还是无意的),同时预测引导RNA是否会在体内引发脱靶效应。


以上体外验证工作是J. Keith Joung团队于2017年完成的工作(发表在《Nature Methods》期刊)。现在,他们将成果转移至体内:利用一引导RNA(在体外预测中,发现其会在基因组中造成数千个错误剪切位点)进行小鼠体内试验。结果显示,超40%的预测位点在小鼠肝脏中确实发生了突变。

而且,在体外预测中,一个位点出现的频率越高,它在体内发生突变的可能性就越大。换句话说,引导RNA在体外是“粗心”的,在体内肯定也是粗心的。

研究团队还检测了小鼠体内试验中基因组上的特殊位点——这些点在计算机预测中都属于可能的脱靶位点,但是在体外试验中并没有出现——结果发现,在体内试验中这些位点并没有出现突变。这意味着,体外试验并没有错过真正的非目标剪切。

更重要的是,他们证实,设计对靶点高度特异性的引导RNA,可以有效指导小鼠肝脏细胞的基因编辑,且不会出现可检测到的非靶向突变。

这项研究证实“你最好确保有一个真正准确的引导RNA”,多伦多大学的发育生物学家Janet Rossant表示,“这项研究的突破性在于,VIVO能够检测出细胞特定的非靶标突变,而不是依赖于参考基因组序列(不一定能够反映你所研究的有机体的遗传背景,或者在临床应用中患者的遗传背景)。由于可以针对来自于患者或者特定有机体的基因组DNA在体外进行筛选,因此测序步骤的读取结果反映了受试者基因组中可能的Cas9目标。”

责编:悠然

参考资料:

New Technique Limits CRISPR-Cas9 Off-Target Mutations

泼冷水!Nature子刊“大发现”:CRISPR可引发数百种“意外突变”!

In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations

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