Nature最新成果!规避CRISPR的“脱靶效应”,关键在引导RNA
2018/09/17
作为最受关注的基因编辑神器,CRISPR技术的临床价值一直有待落实。但是,这一颠覆性技术的“脱靶效应”一直是阻碍其应用的关键障碍之一。近日,科学家们找到了一种预测CRISPR准确性的方法,能够有效限制其错误编辑。


© ISTOCK.COM/KMLMTZ66; © ISTOCK.COM/MACROVECTOR

CRISPR-Cas9基因编辑技术的有效运行依赖于Cas9酶在特定目标位点切割DNA。但是,这一技术却面临着“脱靶”的风险,即Cas9酶可能会在错误的位置剪切。我们都知道,编辑了“预想之外”的基因,很有可能会带来不可预控的严重后果。

通常,我们检测非靶标突变(off-target mutations)的方法是:先利用计算机算法预测出最可能被“错误击中”的区域,然后再检查这些“危险区域”的缺失和插入情况。

9月12日,《Nature》期刊最新发表一篇题为“In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations”的研究,揭示了一种预测基因组编辑中“错误突变”的新策略,并在小鼠试验中证实精心设计的引导RNA链不会产生任何可检测到的错误突变。


https://doi.org/10.1038/s41586-018-0500-9

“脱靶效应”有多严重

非靶向剪切可能发生在对生物功能没有影响的基因组位置,也可能会破坏细胞的基本功能。通常,研究人员会利用计算机程序进行预测,但是这些预测依赖于引导RNA如何与DNA结合以及Cas9如何切割的假设。

2017年5月,《Nature Methods》期刊曾发表一篇文章,揭示CRISPR能够引入数百种意想不到的突变。他们发现,CRISPR确实能够成功纠正引发失明的基因,但两只接受了基因治疗的小鼠的基因组中存在超过1500个单核苷酸突变以及超过100处更大片段的缺失和插入。需要强调的是,这些DNA突变都没有被计算机算法预测出来。

虽然错误概率远超我们的认知,但是我们依然缺乏一种能够准确预测CRISPR非靶标编辑的方法,这意味着,目前我们还不清楚这些预测突变是否会发生以及发生的频率如何。

最新研究:引导RNA 是关键

文章作者、瑞典阿斯利康公司的生物学家Marcello Maresca表示,公司的一个长期目标是能够使用基因编辑技术治疗一些人类疾病。“然而,要想实现CRISPR药物的潜力,就需要开发出一种方法,能够让目标基因得到有效修饰,且基因组其他位置不受影响。”

在这项新研究中,Maresca团队与哈佛大学和麻省总医院的生物学家、病理学家J. Keith Joung课题组合作,开发了一种“体内非靶点验证”的方法(verification of in vivo off-targets,VIVO),可以稳定地鉴定出CRISPR在体内全基因组中的脱靶效应。

首先,他们以小鼠基因组为研究对象,在体外将其DNA剪切成片段,每个片段约包含300个碱基对,然后连接一系列使DNA形成闭环的“接口”(adapters)。随后,他们引入一个Cas9核酸酶和引导RNA复合体,它们会在环状DNA的一些位点上进行切割,使其线性化。最后,研究人员会添加另一批核酸酶,负责降解剩余未被剪切的闭环DNA。

通过这一系列步骤,研究人员可以对线性化的DNA进行测序,以检测Cas9在哪些位置进行了切割(无论是有意的还是无意的),同时预测引导RNA是否会在体内引发脱靶效应。


以上体外验证工作是J. Keith Joung团队于2017年完成的工作(发表在《Nature Methods》期刊)。现在,他们将成果转移至体内:利用一引导RNA(在体外预测中,发现其会在基因组中造成数千个错误剪切位点)进行小鼠体内试验。结果显示,超40%的预测位点在小鼠肝脏中确实发生了突变。

而且,在体外预测中,一个位点出现的频率越高,它在体内发生突变的可能性就越大。换句话说,引导RNA在体外是“粗心”的,在体内肯定也是粗心的。

研究团队还检测了小鼠体内试验中基因组上的特殊位点——这些点在计算机预测中都属于可能的脱靶位点,但是在体外试验中并没有出现——结果发现,在体内试验中这些位点并没有出现突变。这意味着,体外试验并没有错过真正的非目标剪切。

更重要的是,他们证实,设计对靶点高度特异性的引导RNA,可以有效指导小鼠肝脏细胞的基因编辑,且不会出现可检测到的非靶向突变。

这项研究证实“你最好确保有一个真正准确的引导RNA”,多伦多大学的发育生物学家Janet Rossant表示,“这项研究的突破性在于,VIVO能够检测出细胞特定的非靶标突变,而不是依赖于参考基因组序列(不一定能够反映你所研究的有机体的遗传背景,或者在临床应用中患者的遗传背景)。由于可以针对来自于患者或者特定有机体的基因组DNA在体外进行筛选,因此测序步骤的读取结果反映了受试者基因组中可能的Cas9目标。”

责编:悠然

参考资料:

New Technique Limits CRISPR-Cas9 Off-Target Mutations

泼冷水!Nature子刊“大发现”:CRISPR可引发数百种“意外突变”!

In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations

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  • In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations

    CRISPR–Cas genome-editing nucleases hold substantial promise for developing human therapeutic applications1,2,3,4,5,6 but identifying unwanted off-target mutations is important for clinical translation7. A well-validated method that can reliably identify off-targets in vivo has not been described to date, which means it is currently unclear whether and how frequently these mutations occur. Here we describe ‘verification of in vivo off-targets’ (VIVO), a highly sensitive strategy that can robustly identify the genome-wide off-target effects of CRISPR–Cas nucleases in vivo. We use VIVO and a guide RNA deliberately designed to be promiscuous to show that CRISPR–Cas nucleases can induce substantial off-target mutations in mouse livers in vivo. More importantly, we also use VIVO to show that appropriately designed guide RNAs can direct efficient in vivo editing in mouse livers with no detectable off-target mutations. VIVO provides a general strategy for defining and quantifying the off-target effects of gene-editing nucleases in whole organisms, thereby providing a blueprint to foster the development of therapeutic strategies that use in vivo gene editing.

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