PCR用于肿瘤细胞株的端粒酶活性检测的研究
生物探索 · 2018/08/31
端粒是真核生物染色体的末端结构,端粒酶是一种能将端粒DNA加以延伸的酶,近几年的研究充分表明端粒酶的激活与表达程度和恶性肿瘤的形成与转移密切相关,PCR技术在端粒酶酶活性检测方面得到了广泛的应用,一些生物公司提供端粒酶酶活检测服务。端粒酶作

端粒是真核生物染色体的末端结构,端粒酶是一种能将端粒DNA加以延伸的酶,近几年的研究充分表明端粒酶的激活与表达程度和恶性肿瘤的形成与转移密切相关,PCR技术在端粒酶酶活性检测方面得到了广泛的应用,一些生物公司提供端粒酶酶活检测服务。端粒酶作为肿瘤研究上的新靶点,其活性的检测已经成为早期诊断肿瘤及肿瘤生物学行为评估的指端。

聚合酶链反应简称为PCR,在遗传学、法医鉴定、疾病诊断、肿瘤防治和人类基因组计划等方面得到了广泛的引用。美迪西提供酶活检测服务,其生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验,通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等,提供一套完整的生物学服务。

端粒酶在体外可以以其自身rna的模板区为模板,在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列,用聚丙烯酰胺(page)凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。1994年有研究者建立了基于pcr基础上的端粒重复序列扩增法trap。trap反应原理如下:首先合成一个18nt的ts做上游引物,端粒酶结合ts末端的gtt并合成agggttag,然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列,端粒酶灭活后,加入一个24nt的cx做下游引物,经过多次变性-退火-延伸,扩增端粒酶延伸产物。目前端粒酶酶活性检测采用PCR方法灵敏度高,只要反应体系中有5个以上的肿瘤细胞就能检测出。

国外应用最广的检测方法为端粒重复扩增分析(TRAP)同位素掺入标记(放射自显影)法。但因该法使用放射性同位素标记,易有放射性污染且价格昂贵,故在临床上的推广应用受到一定的限制。采用聚合酶链反应-酶联免疫测定(PCR-ELISA)和聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)方法同时检测了白血病细胞系K-562和HL-60细胞的端粒酶活性,结果显示K-562细胞和HL-60细胞有非常高的端粒酶活性,说明端粒酶在白血病细胞系中有强的表达。

通过端粒酶PCR-ELISA和PCR-PAGE方法检测血液肿瘤细胞株HL-60、K562、Raji 的端粒酶活性,探讨其临床应用价值。方法是采用PCR-ELISA方法是将端粒重复序列PCR变性产物与地高辛标记且对端粒重复片段特异的探针杂交,杂交产物通过ELISA进行测定。   

PCR-PAGE法是将端粒重复序列PCR产物直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过硝酸银染色测定端粒酶活性。结果发现在端粒酶PCR-ELISA方法检测中,PCR在25~35次循环之间,吸光度A值与循环次数呈线性关系,35~45次循环已达到平台期。PCR-ELISA法检测显示HL-60、K562、Raji细胞均表达高水平的端粒酶活性,吸光度A均值分别为2 362、2 336、2 145。对HL-60、K562、Raji细胞的端粒重复序列扩增的PCR产物直接进行PAGE电泳、银染均呈现3条以上间隔6bp的特征性阶梯状条带。因此对端粒重复序列PCR产物可同时进行ELISA检测和PAGE-银染,两种方法均可用于恶性肿瘤的临床诊断,ELISA法更为灵敏而简单,且可相对定量。

端粒酶PCR-ELISA方法简单、方便、灵敏,PCR扩增以后,通过特异性探针与PCR变性产物杂交而检测,特异性强,可以避免PCR反应后的假阳性和假阴性,且易于定量,是检测端粒酶活性较理想的方法,将有更广泛的临床应用前景。

利用荧光定量PCR法检测端粒酶抑制剂作用于人肝癌细胞SMMC-7721后端粒酶活性的变化,探讨其抑制端粒酶活性的可能机制,为端粒酶抑制剂的临床应用提供理论依据。方法是利用荧光染料SYBR—Green I建立一种新的端粒酶活性检测方法:FQ—TRAP法。利用FQ—TRAP法检测端粒酶抑制剂作用后肿瘤细胞端粒酶活性变化。结果发现端粒酶抑制剂作用后,肝癌细胞端粒酶活性都有变化,其中以ASODN,EGCG,AZT抑制效果较明显。因此端粒酶FQ—TRAP法是一种特异性、灵敏度、重复性都较好,可快速、简便及定量检测人端粒酶活性的方法,端粒酶抑制剂作用后癌细胞端粒酶活性的变化,为端粒酶抑制剂的临床应用提供理论依据。

除了肿瘤细胞中端粒酶的高活性表达外,在正常人类生殖细胞以及造血细胞、外周白血细胞与淋巴细胞、表皮细胞、肠粘膜基底关系保等具有再生能力的细胞外,均可检测到不同水平的端粒酶活性。端粒酶、端粒与肿瘤的密切相关性,使端粒酶成为当今肿瘤防治领域最受重视的新靶点之一。因此干预端粒酶的激活过程,从而阻断细胞的恶性化转变,在肿瘤的化学预防中具有重大意义。

 


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