浅析基于靶点的抗肿瘤药物筛选策略
生物探索 · 2018/08/31
抗肿瘤药物筛选是新药发现与开发的重要环节,通常是指从样品到活性检测乃至动物实验疗效的各个阶段的工作。在后基因组时代,基于靶点的高通量药物筛选模型已经成为药物开发计划中重要的一个部分。随着组合化学、基因组学以及蛋白质组学的飞速发展,越来越多的

抗肿瘤药物筛选是新药发现与开发的重要环节,通常是指从样品到活性检测乃至动物实验疗效的各个阶段的工作。在后基因组时代,基于靶点的高通量药物筛选模型已经成为药物开发计划中重要的一个部分。随着组合化学、基因组学以及蛋白质组学的飞速发展,越来越多的靶点和小分子库被用于药物筛选。药物靶点有很多,既可以利用直接与肿瘤细胞生长相关的分子靶点,也可以利用与肿瘤微环境相关的分子靶点。利用多种多样的分子靶点,将可能发现具有各种分子作用机制的药物。

药物筛选模型是发现新药的重要条件。新模型的建立将会带动新型药物的出现。美迪西可以为客户提供从分子、细胞、离体标本和整体动物水平的药物筛选服务,其在抗肿瘤、免疫性疾病、抗炎、心血管疾病、镇痛和糖尿病等研究领域建立了相对成熟的药物筛选模型,既包括微量、快速、高自动化的新型高通量初筛模型,又包括深入筛选的各级复筛模型,形成了高效、多层次的新药筛选平台。

对于任何一种新型抗肿瘤药物的开发过程而言,关键的一环是要确保靶点是准确无误的。简言之,通过对药物靶点或通路的直接调节看是否能诱发所期望的表型,来判断靶点是否正确。在药物研发投入巨额资金之前,对靶点的确认可以增加成功概率,规避相应的风险。对于某一假定靶点的验证可以通过多种策略实现,如基因敲低或敲除(RNAi,CRISPR/Cas)、靶点蛋白的过表达(gain of function)、同时采用细胞株及小鼠模型(包括肿瘤异源移植模型)等。

当前用于抗肿瘤药物筛选模型的靶点种类很多,主要有细胞周期调控信号转导、细胞死亡通路、耐药性侵袭转移和血管生成等。抑制血管生成的药物筛选模型的建立是利用血管生成与肿瘤的关系建立的。因为血管生成与肿瘤有密切的联系,因此有些体内和体外的分析系统已被用于筛选抑制血管生成药物。端粒酶也是抗肿瘤药物筛选的新靶点,普遍认为端粒酶是一种新的、很有价值的肿瘤标志物。肿瘤细胞生长的基本特征是细胞失控增殖,其细胞周期及关卡调控失常,故细胞周期蛋白依赖性激酶和关卡激酶可能作为抗肿瘤药物的靶点。

基因组计划能够快速的确定一些特定路径中的蛋白-蛋白相互作用,另一方面各种高通量的筛选系统能够针对特定靶点进行高效快速的化合物分子库筛选。高质量的化学探针不仅可以完成靶点确认,而且能够展示分子与靶点的相互作用细节。靶点确证本身并不能保证小分子药物开发的成功,毕竟不同类型的靶点所面临的挑战和困难各不相同,即所谓的靶点“成药性”。不管是生物药还是小分子化药,研发过程中的失败原因都具有多样性;但却是有很多案例摆在对于靶点缺乏认知上。对于药物研发项目而言,启动高通量筛选过程并不是最困难的,更为重要的是需要表明靶点与癌症之间的关联性。

高通量筛选中所用到的药物发现策略通常可分为细胞基础上的表型筛选及靶点基础上的生化筛选。基于靶点的药物发现往往采用生化或细胞基础上的检测,直接作用于已确认的靶点分子。

在绝大多数情况下,采用纯化后的蛋白开展高通量筛选检测具有很多优势。当某一蛋白分子的酶活性或与其他分子间相互作用已被清晰阐明后,通过纯化后的重组蛋白就可以来筛选能够影响某项蛋白功能的化合物分子。筛选过程可以采用不同的生化检测形式:如采用荧光标记产品可以直接读取结果;同报告基因偶联来间接检测;或偶联到单独的光谱、质谱设备等来直接定量反应产物。采用生化检测方法的另一个优势是可以有偏好性的发现一些具有独特机理的抑制剂。对于一个具有辅因子,如NADPH的酶分子而言,我们通常希望获得结合在辅因子结合位点之外的抑制剂;这时可以通过增大辅因子浓度,使其远超KM浓度的情况下开展筛选试验。

蛋白与蛋白间相互作用(PPIs,protein-protein interactions)是公认的比较难于开发药物的靶点,但在药物开发中具有很重要的地位,特别是需要破坏蛋白复合体的形成或信号转导通路的药物领域。Venetoclax于2016年4月11日获美国FDA批准上市,又于2016年12月5日获得欧洲EMA批准上市,用于治疗带有17p基因缺失突变并且曾接受过至少一种治疗的慢性淋巴细胞白血病患者。它选择性的结合BCL-2分子而阻止其同促凋亡蛋白的结合,从而诱导CLL肿瘤细胞的程序性死亡。

对于PPI及其他分子间的相互作用可以采用邻近分子信号传递相关的检测方法,这些手段的共性是信号对于标记分子的结合或解离十分敏感,常见的有荧光共振能量转移(FRET,Förster resonance energy transfer),时间分辨荧光能量转移(time-resolved fluorescence energy transfer),放大化学发光亲和均相检测(ALPHA,Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay)及荧光偏振(fluorescence polarization)。   

很多抗肿瘤药物作为相互作用面抑制剂,通过与靶点间形成三元复合体,稳定毒性中间体的状态而破坏蛋白-蛋白间相互作用(微管蛋白抑制剂类药物)或蛋白-DNA间的相互作用(拓扑异构酶抑制剂类药物)。用以筛选相互作用面抑制剂的检测方法必须对大分子复合体的稳定性十分敏感,而这一点在目前的高通量筛选及药物发现过程中应用尚不多见。采用体外纯化的靶点蛋白开展研究还可以采用诸如热力学和动力学,以及结构生物学研究等生物物理手段来表征先导化合物特征。

如今药物筛选已经突破了传统的生物学范畴,而成为一个化学、生物学和工程学共同作用的过程。相信随着基于靶点的高通量药物筛选方法的不断完善以及仪器设备的不断改进,高通量药物筛选模型将在新药研制过程中发挥更大的作用。


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