在水稻胚乳中表达细胞因子的研究
生物探索 · 2018/08/22
生物技术药物作用巨大,目前绝大部分生物技术药物是采用动物或微生物细胞表达体系生产的。与动物及微生物细胞表达体系相比,采用植物细胞进行药用重组蛋白表达,具有成本较低、安全性高、易于储存运输和具有人源化活性等优点。在植物表达系统中,水稻胚乳是公

生物技术药物作用巨大,目前绝大部分生物技术药物是采用动物或微生物细胞表达体系生产的。与动物及微生物细胞表达体系相比,采用植物细胞进行药用重组蛋白表达,具有成本较低、安全性高、易于储存运输和具有人源化活性等优点。在植物表达系统中,水稻胚乳是公认的药用重组蛋白表达的理想工具之一。

细胞因子(Cytokine, CK)是细胞间相互作用的一种化学物质,由免疫细胞和非免疫细胞合成分泌的一类有多种生物活性的小分子多肽或糖蛋白。由于天然的细胞因子只是在局部发挥短暂的作用,难以提纯,所以需要应用蛋白重组技术获得。

重组蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术,在基因工程技术中占有核心地位。目前我国的一些医药研发外包服务机构如美迪西,提供的就有重组蛋白表达服务这一项。美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以在蛋白表达与纯化方面提供多种选择,拥有从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系。

水稻是全国一半以上人口的主食,无潜在过敏性,在其胚乳中表达的蛋白遭受蛋白酶降解的可能性极低。同时水稻胚乳特异表达系统技术已经趋于成熟,是表达药用重组蛋白非常适合的工具。

水稻胚乳细胞生物反应器技术,是以分子生物学为原理,应用遗传工程和DNA重组,以水稻胚乳作为“生产车间”高效表达各类蛋白质,包括胚乳特异性表达、蛋白定向储存、重组蛋白质的提取以及纯化技术。将可部分取代基于微生物发酵和动物细胞培养等重组蛋白药物的传统生产方式,对我国乃至国际的生物医药生产方式产生较大影响,对推动我国生物医药的发展具有重要意义。

如何将蛋白质导入水稻中

首先克隆出此蛋白质的基因,然后把这段基因插入到双元农杆菌载体DNA中,带有此蛋白质的质粒重组到水稻基因中与水稻自身的基因组整合为一体,最后这个整合后的基因组在水稻植株中表达形成转基因植株,从而重组蛋白也随着水稻自身的基因通过转录、翻译、折叠等一系列过程表达出来。在水稻胚乳表达体系研究中,关于细胞因子的研究极为广泛。

有研究人员建立了一套水稻胚乳种子特异表达系统,采用水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动GluB-1及其信号肽驱动经水稻偏好密码子优化人白细胞介素编码基因hIL-10,同时在基因3'端添加内质网滞留信号(KDEL),转基因水稻中hIL-10蛋白表达水平达到每粒稻谷219μg;该研究组还建立了从转基因水稻种子种提取hIL-10蛋白的方法,并分析了所表达蛋白的生物活性,发现水稻种子生产的hIL-10 蛋白有较强生物活性,可通过生物载体形式导入肠相关淋巴组织有效地治疗过敏症和自身免疫疾病。

也有研究者采用相同的策略在水稻胚乳中特异表达白细胞介素hIL-7,发现其表达量最高达到每粒种子5~10μg。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子为升白细胞药,对造血系统有广泛的作用,能刺激粒细胞和巨噬细胞的增殖、分化及活化,增加造血功能;也能增强中性粒细胞、嗜酸性细胞及单核粒细胞的多种功能;提高免疫效应细胞吞噬细菌及杀灭癌细胞等免疫活力,恢复因肿瘤化疗和骨髓移植引起的中性粒细胞缺乏。研究者使用水稻种子特异表达的谷蛋白启动子驱动重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF) 编码基因,结果CSF表达水平达种子可溶性蛋白的1.3%;人TF-1细胞检测表明水稻胚乳来源的CSF具有较好生物学活性。但其在纯化后仍难以达到商业化生产所需的种子重量0.1%的标准。

为提高目标蛋白表达量,还有研究者采用谷蛋白启动子Gt13a及其信号肽驱动经密码子优化的CSF基因,目标蛋白表达水平达到每粒种子0.5 ~14μg。该表达系统也被用于表达重组胰岛素样生长因子-1和碱性成纤维细胞生长因子( FGF),并都获得很好的表达效果。然而,这些研究中目标蛋白提取效率都比较低。要实现转基因植物源药用重组蛋白在商业化规模上生产,必须加快发展水稻胚乳小肽类物质的分离纯化技术。

采用胚乳细胞特异性表达,信号肽介导重组蛋白质定向储存,目的基因的水稻密码子优化等技术策略,不仅可以使重组蛋白像储存蛋白一样在蛋白体中大量积累而达到高效表达,而且可以防止细胞质蛋白酶的降解,在蛋白质转运过程中还可以对重组蛋白质进行加工修饰,获得具有生物活性的重组蛋白质。再利用水稻储存蛋白与重组蛋白的生化性质差异,将重组蛋白提取出来并进行纯化。

 

 


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