人细胞色素P450在大肠杆菌中表达的一般策略
生物探索 · 2018/08/06
细胞色素P450是肝脏的主要药物代谢物,参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。大肠杆菌表达系统是最常用的表达系统,其使用比较广泛且经济实惠,是基因工程中不可缺少的工具。人细胞色素P450(P450,CYP)在大肠杆菌E

细胞色素P450是肝脏的主要药物代谢物,参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。大肠杆菌表达系统是最常用的表达系统,其使用比较广泛且经济实惠,是基因工程中不可缺少的工具。人细胞色素P450(P450,CYP)在大肠杆菌E.coli中的功能表达对新药研发,临床药物治疗和药物早期ADME/T性质研究均有重要意义。人细胞色素P450在大肠杆菌中表达的常用的策略有以下几种。

1、在胞质中表达重组的人P450酶

原核表达系统(大肠杆菌表达系统)是基因表达技术中发展最早,应用最广泛的经典表达系统,近几十年,大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善,被科研及工业用户大量用于各种重组蛋白表达。美迪西是一家临床前CRO公司,建立了成熟的大肠杆菌表达及纯化服务平台,提供包括各种重组蛋白以及其复合物在大肠杆菌中的表达与纯化服务。

自1990年代以来,人们在大肠杆菌表达系统的研究中取得长足进步,积累了大量经验,在蛋白直接表达、融合蛋白表达和分泌表达等方面均有显著进展。在E.coli细胞不同隔室表达人P450的方法均有报道,大部分研究将人P450表达在胞质,然后通过N端的膜锚定序列(MALLLAVFL,通常少于30个氨基酸残基)使其位于膜上。发现N端序列影响重组酶的亚细胞分布,且每种酶都有其它区域参与其膜附着,使活性位点位于细胞质一侧。

哺乳类P450比低等生物P450难表达,因为它们更疏水,要求结合血红素,且重组蛋白能否正确折叠是个问题。1991年,Waterman研究组首次成功用E.coli表达出有催化活性的牛P45017A1,在用细菌表达哺乳类P450方面取得突破。Waterman等用pCW载体构建了表达质粒,此后这个载体被广泛应用于表达不同种类的人P450。他们在构建表达质粒时考虑了细菌和哺乳类在遗传密码使用(codon usage)上的差异,故对N端序列进行了修饰,以便于E.coli的蛋白翻译。一般认为N端序列只起膜锚定作用,在P450催化循环、底物结合,与CPR和b5的互作等方面不起作用。目前大多数人P450表达研究都采用N端修饰的方法。

2、DNA克隆和菌培养

用pCW的蛋白表达受控于两个tac启动子,它们位于N de I(CATA TG,ATG正好是翻译起始密码子)限制酶克隆位点上游。pCW还有一个很强的trpA转录终止子,一个噬菌体M 13 DNA复制起点,和tacI q基因,tac阻抑蛋白的作用是防止加入IPTG前从tac启动子起始转录。

3、菌株

DH5A和J M109是最常用的菌株,也有用J M105和MV1304成功表达的报道。E.coli菌株C41 (DE3)其胞内膜结构丰富,可供短时大量表达的异源P450附着,并能耐受P450mRNA的毒性。Cheng等用此菌株和pL W01表达兔CYP2E1,表达水平达到900~1400n mol/L,而用以前的菌株仅为100nmol/L。此菌株及另一相近菌株C43较昂贵,尚无用于人P450表达的报道。

4、N端序列的修饰

N端修饰的原则是尽量用E.coli中常见的密码子以便于蛋白翻译起始。例如,把P450第二密码子由TGG(Trp)改为GCT(Ala),因后者是E.coli lac Z基因表达偏好的第二密码子。密码子4和5改为TTA,密码子6和7的最后一位改为A和T,因为E.coli mRNA的这个区域富含腺嘌呤和尿嘧啶。这些变动减少稀有密码子的使用,减少mRNA形成二级结构,使翻译起始顺畅。

N端修饰常用PCR定点突变方法实现,对每个人P450需要尝试多个修饰方案,通常其中只有少数可见表达水平提高。已发现一个通用的N端序列(MALLL AVFLGLSCLLLLS)适于表达CYP2C(2C8,9, 18,19)。通过对比E.coli表达的N端修饰的人P450和昆虫细胞表达的无N端修饰的同种酶证实,N端修饰不影响P450的催化性质。最近,Yun等首次报道无N端修饰的人CYP1A2在D H5AF.I Q中的表达,32e48h,野生型1A2可达650nmol/L,与经N端修饰的表达水平相当。尽管重组野生型1A2的活性位点催化环境与经N端修饰的稍有差异,两者总的酶活性相当。

药物相互作用(drug-druginteraction,DDI)是指2种或2种以上的药物所产生的物理或者化学变化,以及由于这些变化所造成的药效改变。药物的相互作用可发生于药物在人体内吸收、分布、代谢和排泄等过程,其中以代谢性相互作用为主,约占40%。代谢性相互作用主要与参与药物代谢的酶有关,其中以细胞色素P450(CYP450)为主,临床上90%以上的DDI都是由CYP450酶的活性改变引起的。因此P450酶在药物代谢研究方面应用的潜力巨大,其在大肠杆菌表达系统的研究促进了其在医学研究领域上的应用。


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