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“魔剪”剪切后,细胞如何修复?Nature子刊:没那么简单

2018/08/04 来源:生物探索
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导读
CRISPR自问世以来一直被寄予厚望,但是对于它在细胞中的作用细节,依然有很多未知。近日,科学家们发现,过去对于“细胞在Cas9酶剪切DNA后修复基因”的假设是错误的,细胞修复“魔剪”造成的DNA断裂完全不同于最初的假设。


IrvineNIST

7月27日,《Nature Genetics》期刊最新发表了这篇题为“CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway”文章。来自于加州大学伯克利分校的科学家们发现,一条罕见的DNA修复途径——范可尼贫血通路(Fanconi anemia pathway)在修复由“魔剪”CRISPR-Cas9编辑造成的双链DNA断裂过程中发挥着关键作用。而且,范可尼贫血通路类似于“交通警察”,引导简单的末端连接或者新的单链DNA伤口修补。

这项发现揭示了为什么CRISPR-Cas9技术几乎在所有尝试过的细胞中都非常有效(虽然并不是所有细胞都获得相同水平的成功),有助于帮助科研人员提高在基因组中插入新DNA(例如用正确的DNA序列替换有害的突变)的效率,并确保CRISPR编辑获得预期的结果。

“基因编辑潜力很大,但是当前面临很多风险和错误。”文章作者、加州大学伯克利分校分子和细胞生物学教授Jacob Corn强调,“它在人类细胞中的工作方式一直是一个有着很多假设的‘黑匣子’。现在,我们的工作是开始解开这一谜团。


CRISPR依赖于DNA修复

CRISPR-Cas9是一项革命性技术,能够从数十亿基因组中精确地提取出特定的DNA。编辑工作之后,就是细胞的自我修复了。通常,DNA修复可通过两种方式进行:

1) 非同源性末端连接(non-homologous end-joining),通过特定的酶将切开的末端缝合在一起,这一方式通常会导致一个或多个碱基被添加或删除,从而容易破坏基因功能,起到“基因敲除”的效果。这是CRISPR切割后最常见的结果;

2) 同源介导修复(homology-directed repair),利用单链DNA模板,引入新的序列,对基因进行编辑。这一方式在某些类型的细胞中发生的频率比其他类型的细胞要高,并且需要一段可以用来修补切口的DNA片段。研究人员经常提供单链DNA片段,并且希望细胞用它来替换有缺陷的序列。

然而,这两个过程有点神秘,没有人知道为什么一些细胞更容易插入DNA,而另一些细胞却很少这么做。

“将CRISPR-Cas9应用于医学或合成生物学应用的热情是巨大的,但没有人真正知道它植入细胞后会发生什么。”文章一作、加州大学伯克利分校博士后Chris Richardson表示,“它会产生DNA断裂,然后需要细胞启动修复机制。但是我们并不了解这背后的细节。”

解开谜团

为了找出哪些DNA修复酶才是CRISPR剪切之后同源定向修复的关键,Richardson和Corn采用CRISPR干扰(CRISPR interference,CRISPRi)技术在同一时间敲除超2000个已知或者潜在的与DNA修复有关的基因。

令人惊讶的是,许多被证明很重要的基因(一旦沉默,同源定向修复会急剧下降)似乎与CRISPR没有关系。而且,他们发现了一条罕见的基因修复通路,即范可尼贫血通路,证实其在CRISPR编辑中发挥重要作用。

范可尼贫血是一种罕见且严重的遗传性疾病——源于不能产生足够多的新鲜血细胞,临床表现为多样化先天畸形、进行性骨髓衰竭、色素沉着症、恶性血液系统肿瘤及实体瘤倾向。很少有病人活到30岁以上。

科学家们对这一病理研究已超10年,发现范可尼贫血通路涉及21种不同的蛋白质,一旦任意一个蛋白受损,人们就会患上范可尼贫血。此外,该通路更倾向于修复一个特定类型的DNA损伤——DNA链间交联(DNA interstrand crosslinks),可轻易阻断DNA复制、转录和重组,属于毒性最强的一种DNA损伤,可以轻易杀死复制中的细胞。

20世纪80年代,研究人员曾发现,同源介导修复与范可尼贫血通路之间存在关联,但是这一线索一直被忽略。

“根据我们的研究,我们认为,范可尼贫血通路在修复其他类型的病变中同样发挥着重要的作用,但是最精彩的是修复双链断裂。” Richardson表示,“在Cas9编辑之后,范可尼贫血通路可以插入新的DNA。

颠覆旧识

这一发现引发了新的质疑:如果范可尼贫血通路未曾激活,细胞可能无法在基因编辑之后用正常基因替换突变的基因。事实上,范可尼贫血通路的活性水平可能会影响CRISPR精确在特定细胞中插入DNA的效率。

研究人员得出结论:虽然非同源性末端连接是双链断裂后的默认修复机制,但是范可尼贫血通路会与之竞争,活性越高会导致更多的同源介导修复、更少的端连接。

研究意义

这些发现不仅有助于科学家们更好地了解细胞的DNA修复机制,还可以帮助他们开发针对癌细胞DNA修复的抗癌疗法。

Richardson发现,关联范可尼贫血通路的21种蛋白质中的FANCD2蛋白总是位于CRISPR-Cas9创建的双链断裂的位置。这意味着,FANCD2在调控新DNA插入基因组剪切位点中发挥着重要作用。科学家们推测,FANCD2可以被微调,从而提高细胞通过同源定向修复插入DNA的频率。

“此外,考虑到FANCD2位于Cas9剪切的位置,我们或许可以利用FANCD2来绘制Cas9在任何细胞类型中切割的位置。” Richardson设想道。

科学家们可以对参与这一通路的蛋白质进行“人为调整”,优先引导DNA置换结果,这对于基因治疗遗传疾病很重要。

“如果你想要治疗镰状细胞贫血,成功率与你使用正确的基因替换缺陷基因的效率密不可分。”Richardson解释说,“如果你从病人身上采集一百万个细胞,最终获得10%的插入率,自然没有30-40%那么好。”

责编:风铃

参考资料:

DNA repair after CRISPR cutting not at all what people thought

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