案例分享 | 欧易助力发现lncRNA调控胃癌的新机制
生物探索 · 2018/03/15
胃癌是威胁人类生存和健康的巨大杀手。 文献证实lncRNA与肿瘤细胞的转移、侵袭、增殖和凋亡息息相关,研究lncRNA在胃癌中的表达和作用机制,有助于我们找到胃癌诊断的标记物和治疗靶点。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度大于200nt,不编码蛋白的RNA。lncRNA在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用,与多种癌症息息相关,包括乳腺癌、胃癌、肺癌和前列腺癌等。研究的方面主要集中在肿瘤细胞的转移、侵袭、增殖和凋亡等。因此,lncRNA目前是生命科学领域的一个研究热点。今天就通过欧易客户最新发表的一篇文章,为大家介绍一下lncRNA参与调控胃癌的新机制。

文章通讯作者为上海交通大学医学院附属仁济医院的王红霞教授、上海交通大学医学院附属第九人民医院的张建军教授和复旦大学附属中山医院的刘天舒教授。

文章于2018年2月发表在CellDeath & Disease(影响因子:5.965)。

其中,文章中lncRNA的芯片检测由欧易生物完成。

文章概述

作者通过筛选lncRNA寻找胃癌诊断的标记物和预后检测的靶标,探索其在胃癌中的作用机制。通过从表型到机制再到应用的思路,可以将文章框架分为三个部分。

第一部分,作者首先对20对组织(胃癌及对应癌旁组织)进行lncRNA芯片筛选,最终锁定了PANDAR(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA),并证实PANDAR可以作为胃癌诊断的标记物和预后检测的靶标。

随后,在第二部分,作者探讨了PANDAR在癌症发展中的作用机制,发现PANDAR可以竞争性结合p53蛋白调控 CDKN1A基因的转录。

第三部分,找到了PANDAR的作用机制后,作者通过体内实验证明敲除PANDAR联合nutlin3可以抑制肿瘤细胞的生长,具有明显的抗肿瘤效应,因此可能成为潜在的肿瘤治疗靶点。

研究背景

1. 胃癌是威胁人类生存和健康的巨大杀手。文献证实lncRNA与肿瘤细胞的转移、侵袭、增殖和凋亡息息相关,研究lncRNA在胃癌中的表达和作用机制,有助于我们找到胃癌诊断的标记物和治疗靶点。

2. PANDAR是一个较新颖的lncRNA,与肿瘤发展、淋巴结转移等相关。

3. p53是与癌症密切相关的转录因子,在DNA出现损伤后,可以引发细胞周期停滞或者消灭细胞,具有促进细胞周期停滞和细胞凋亡功能。

研究内容

1. 胃癌病人中PANDAR的过表达表明病情在恶变

作者首先对20对组织(胃癌及对应癌旁组织)进行lncRNA芯片筛选,最终锁定了PANDAR(Fig. 1A,B,C)。PANDAR的表达与肿瘤大小(Fig. 1D)、TNM阶段(Fig. 1E)和死亡率(Fig. 1F)显著相关。随后,作者通过ROC分析表明PANDAR可以作为一个标志物区分胃癌早期组和健康组(Fig. 1G)、胃癌转移组和非转移组(Fig. 1H)、化疗耐药组和非耐药组(Fig. 1I)。

2. PANDAR促进胃肿瘤细胞的恶性发展

作者发现胃肿瘤细胞中PANDAR的表达量显著高于正常细胞(Fig. 2A,B),并认为PANDAR的高表达可能是由于其启动子的去甲基化造成的(Fig. 2C)。之后,作者利用CRISPR/Cas9敲除PANDAR,发现敲除PANDAR后的肿瘤细胞增殖和克隆形成能力显著下降(Fig. 2D,E,F)、细胞凋亡活性提高(Fig. 2G)。过表达PANDAR发现,肿瘤细胞增殖和克隆形成能力显著上升(Fig. 2H,I,J)、细胞凋亡活性下降。由此,PANDAR促进了肿瘤细胞的恶性发展。

3. PANDAR通过p53蛋白调控 CDKN1A基因的转录

通过PANDAR的敲除和过表达,作者找到了PANDAR的靶基因CDKN1A(Fig. 3A,B)并发现PANDAR和p21呈剂量依赖性关系,当敲除p53后,p21的表达量并没有变化(Fig. 3D)。因此,PANDAR是通过p53蛋白调控 CDKN1A基因的转录。

4. PANDAR干扰p53蛋白和CDKN1A启动子的结合

作者设计了一个竞争性的实验探究PANDAR和p53的关系(Fig. 4A,B)。通过检测残余的p53蛋白的量发现,PANDAR可以干扰p53蛋白和CDKN1A启动子的结合(Fig. 4C,D)。

随后,作者用肿瘤细胞总RNA代替合成的PANDAR,再次验证了上述结果(Fig. 4E,F,G)。敲除PANDAR后,p53蛋白保持与CDKN1A启动子的相互作用,形成p53:CDKN1A复合物(Fig. 4H,I,J)。所以,作者认为PANDAR干扰p53蛋白和CDKN1A启动子的结合。

5. PANDAR直接与p53蛋白相互作用

基于PANDAR可以干扰p53和CDKN1A启动子结合,作者想知道PANDAR能否和p53直接相互作用。利用RIP和RNA pull-down实验作者发现PANDAR可以直接与p53蛋白相互作用(Fig. 5A,B),并找到了各自的互作部位(Fig.5 C,D,E,F,G,H,I,J)。

6. 敲除PANDAR联合nutlin-3可以抑制体内胃肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡

通过敲除PANDAR联合nutlin-3处理肿瘤细胞发现,p21蛋白的表达量升高(Fig. 6A)、细胞复制周期停滞(Fig. 6B)、细胞凋亡活性提高(Fig. 6C),并证明两者具有协同作用(Fig. 6D,E,F)。体内实验表明,敲除PANDAR联合nutlin-3可以明显减少肿瘤的大小和重量(Fig. 6G)以及抑制肿瘤细胞繁殖(Fig. 6H)。因此PANDAR可能成为潜在的肿瘤治疗靶点。

文章亮点

1. 通过lncRNA芯片精准筛选到了目标分子,找到了胃癌诊断的标记物和预后检测的靶标,研究了lncRNA对靶基因的调控机制并探索了lncRNA在癌症治疗中的潜在应用(表型-机制-应用)。

2. 文章数据量丰富,分别从各类表型(细胞复制周期、肿瘤大小、TNM阶段)、多种实验手段(RIP、qRT-PCR、RIP、Western Blot、RNA pull-down等)、不同表达水平(体内、体外)等解析和验证。

参考文献

Liu J, Ben Q, Lu E, et al. Long noncoding RNA PANDAR blocks CDKN1A gene transcription by competitive interaction with p53 protein in gastric cancer[J]. Cell death & disease, 2018, 9(2): 168.

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41419-017-0246-6

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