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过去的理论又错了,两篇研究长文报道CTLA-4抗体在肿瘤免疫治疗中的新机制新模型

2018/03/08 来源:BioArt
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导读
如何提高抗CTLA-4抗体在肿瘤免疫治疗中的效果,并减少其诱发的免疫副作用,一直是癌症免疫治疗中的一个难题。日前,Cell Research在线发表了来自美国马里兰大学医学院刘阳/郑盼教授联合实验室在此领域的最新研究成果。这两篇研究文章(Article)分别报道了抗CTLA-4抗体在肿瘤免疫治疗中的新机制和新模型。


本文转载自“BioArt”。

这两项研究表明,长久以来流行的抗CTLA-4抗体Ipilimumab在癌症免疫治疗中的免疫检查点假说并不成立,即Ipilimumab并没有通过阻断CTLA-4/B7相互作用而发挥抗肿瘤效果,而清除Fc受体介导的高表达CTLA-4的肿瘤局部调节性T细胞(Treg)则在有效的免疫治疗中至关重要。作者利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型,模拟临床上Ipilimumab单用以及联用造成的各个脏器的免疫副作用,并评估了其它抗CTLA-4抗体的安全性,阐明了失调的自身反应性Treg及全身T细胞的活化是造成免疫副作用的根本原因。这些研究成果对今后研发新一代高效并且安全的抗CTLA-4抗体以及其它以CTLA-4为靶点的药物有着深远的指导意义。

近年来,随着肿瘤免疫调控机制的逐渐清晰和基因改造技术的不断提高,肿瘤免疫治疗领域得到了空前发展。尤其是近几年来,免疫检查点 (Immune Checkpoint)单抗药物与嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞免疫治疗的效果逐渐获得认可,癌症免疫治疗的概念也越来越深入人心。目前肿瘤免疫药物治疗的最主要方面是肿瘤免疫检查点抑制剂,即通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸,调动自身免疫系统功能来消除肿瘤,当前的研究主要集中在CTLA-4、PD-1和PD-L1三个分子上。

CTLA-4分子高表达于调节性T淋巴细胞(Treg)和激活的T淋巴细胞上。正常情况下,T淋巴细胞的活化需要两条信号通路共同激活,其一是T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)呈递的MHC-抗原肽复合物相结合(信号1),其二是B7分子(B7-1或B7-2)与T细胞表面的共刺激分子CD28相结合(信号2)。T细胞活化后高表达的CTLA-4分子虽然与CD28具有高度同源性,但功能相反,即CTLA-4分子与B7分子结合后抑制T细胞的活化。

2011年,美国FDA批准首款抗CTLA-4抗体抑制剂Ipilimumab(商品名YERVOY®)用于黑色素瘤的治疗,疗效显著。根据免疫检查点阻断的假说(Checkpoint Blockade Hypothesis),在外周淋巴器官,抗CTLA-4抗体如Ipilimumab是主要通过阻断抑制性的CTLA-4/B7信号通路【图1】,从而促进T细胞的激活而发挥抗肿瘤作用。然而这一流行的关于Ipilimumab在癌症免疫治疗中发挥作用的主要假说并没有得到严格的实验验证。


图1. T细胞的活化需要通过TCR/MHC(信号1)和CD28/B7(信号2)进行共刺激。 抗原呈递细胞(APC)上的B7分子(包括B7-1和B7-2)与T细胞上的CTLA-4的结合抑制T细胞功能。 抗CTLA-4抗体阻断CTLA-4结合B7并阻止其对T细胞功能的抑制。

虽然Ipilimumab可以阻断锚定状态的(Immobilized )CTLA-4分子和游离的(Soluble )B7分子的相互作用【图2A】(J Immunol. 2003 Dec 1;171(11):6251-9.),但B7分子是膜表面表达的共刺激分子,因此以前的研究并不能证实Ipilimumab能够有效阻断在生理状态下的CTLA-4和B7的相互作用。刘阳/郑盼教授联合实验室的研究表明,当B7分子被固定后(比如B7包被在ELISA板上时【图2B】或者表达在细胞表面【图2C】),Ipilimumab(包括临床上使用的Ipilimumab以及按照已公布的抗体序列由不同公司合成的Ipilimumab)在体外并不能很好地阻断细胞表面的CTLA-4/B7的相互作用【图2D】,也不能有效地阻断CTLA-4介导的B7分子的转胞吞(Transendocytosis)作用【图2E】。与此不同的是,刘阳/郑盼教授联合实验室筛选出的另外一种抗CTLA-4的半人源化的抗体L3D10 (Blood. 2005 Feb 1;105(3):1114-20.和Blood. 2005 Nov 1;106(9):3127-33.),却能非常显著地阻断各种形式的CTLA-4/B7的体外相互作用【图2】。 此外,在human CTLA-4 knock-in的人源化小鼠和human CD34+ stem cells重组的NSG小鼠中,L3D10——而不是Ipilimumab——能够显著抑制human CTLA-4对脾脏树突状细胞表面B7分子的转胞吞下调【图2F】,从而提供了在体内实验中的生理状态下Ipilimumab不能有效阻断CTLA-4/B7相互作用的证据。


图2. 当B7分子被固定时,L3D10——而不是Ipilimumab——能够在体外和体内显著阻断CTLA-4/B7的相互作用。(摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0)

更重要的是,刘阳/郑盼教授联合实验室的研究指出,阻断CTLA-4/B7的相互作用,并没有贡献于抗CTLA-4抗体的抗肿瘤效果。这一论断来自多个方面的实验证据:

1)在human CTLA-4全人源化(CTLA4h/h,即CTLA4的两个等位基因均来自human)的小鼠模型中,抗human CTLA-4的抗体L3D10能够有效阻断CTLA-4/B7的相互作用;而在human CTLA-4半人源化(CTLA4h/m,即CTLA4的两个等位基因一个来自human,一个来自mouse)的小鼠模型中,只能识别human CTLA-4的L3D10不能有效阻断CTLA-4/B7的相互作用。尽管如此,在CTLA-4全人源化和半人源化的小鼠模型中,L3D10和Ipilimumab都能有效的消除MC38肿瘤【图3A、图3B】和减缓B16肿瘤的生长。

2)将半人源化的L3D10进行完全人源化后筛选得到的两株失去阻断CTLA-4/B7相互作用能力的HL12和HL32抗体【图3C】,并没有影响其抗肿瘤的作用,因为HL12和HL32展现出与Ipilimumab一样的抗肿瘤效果【图3D】。

3)用B7分子的阻断性抗体1G10/GL1处理实验小鼠,在事先阻断B7功能的情况下,Ipilimumab仍能发挥有效的抗肿瘤作用,进一步说明其并不依赖于阻断抑制性的CTLA-4/B7信号通路【图3E】。

4)三种常见的抗mouse CTLA-4抗体(4F10/9D9/9H10),它们阻断CTLA-4/B7相互作用的能力差别很大(如9D9和L3D10一样具强阻断能力,而9H10则不显示或者具备非常弱的阻断能力)。然而,文献报道它们都具备非常好的抗肿瘤作用。


图3. 抗CTLA-4抗体治疗肿瘤的主要分子机制是通过清除肿瘤局部的Treg,而不是通过阻断CTLA-4/B7相互作用的抑制性信号通路。(摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0)

深入研究表明,所有能有效抗肿瘤的抗CTLA-4抗体,包括强阻断能力的L3D10和非常弱阻断能力的Ipilimumab/HL12/HL32,都能够有效的清除肿瘤局部的Treg【图3F,图3G】。而用Fc受体的阻断抗体2.4G2同时处理小鼠来消除抗体介导的细胞杀伤作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)和抗体介导的细胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis,ADCP),则能显著逆转Ipilimumab的抗肿瘤效果【图3H】。因此,刘阳/郑盼教授联合实验室的研究表明,抗CTLA-4抗体发挥治疗肿瘤功效的主要分子机制是通过清除肿瘤局部的Treg,而不是通过阻断CTLA-4/B7相互作用的抑制性信号通路。这项研究有力地驳斥了当前流行的在癌症免疫治疗中针对CTLA-4分子的免疫检查点的理论假说。

刘阳/郑盼教授联合实验室在CTLA-4领域的另一个方面的研究,集中在建立和评估抗CTLA-4抗体在免疫治疗诱导的副作用(irAE,immunotherapy related adverse events)的小鼠模型。Ipilimumab作为肿瘤免疫治疗的杰出代表,具有非常好的抗黑色素瘤的作用,同时也有非常强的免疫治疗诱导的副作用(N Engl J Med. 2015 Jul 2;373(1):23-34.)。临床研究表明,针对多靶点的更有效的联合用药是免疫治疗的临床推进方向,例如Ipilimumab和Nivolumab (抗PD-1的抗体)强强联合后抗肿瘤效果大增。然而,一半以上的患者产生了3-4级严重的副作用,因此限制了抗CTLA-4抗体的研发与应用(Lancet Oncol. 2017 Jan;18(1):31-41.和N Engl J Med. 2017 Nov 9;377(19):1824-1835.)。 目前,并没有一个非常好的临床前模型来评估抗CTLA-4抗体的免疫治疗诱导的副作用。


图4. 利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型来模拟临床上Ipilimumab单用以及联用造成的免疫副作用,并评估Ipilimumab和其它抗CTLA-4抗体的安全性。(摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z)

研究发现, CTLA-4人源化的新生小鼠模型【图4A】,可以用来有效地模拟临床上Ipilimumab单用以及联用造成的各个脏器的免疫副作用。这些副作用的表型和临床发现的Ipilimumab单独治疗或联合抗PD-1抗体治疗后产生的副作用表型非常相似【图4B】。比如,贫血,心肌炎,肺炎,肝炎,肾脏等多器官炎症。值得注意的是,半人源化抗体L3D10以及其完全人源化后的突变体抗体HL12和HL32在取得与Ipilimumab一样的甚至强于Ipilimumab的抗肿瘤效果的情况下,并没有产生严重的副作用【图4C】。同样,利用human CTLA-4全人源化(CTLA4h/h )和半人源化(CTLA4h/m)的新生小鼠模型,研究者发现,再现Ipilimumab的免疫副作用需要CTLA4双等位基因的参与,因为在半人源化新生小鼠模型中, Ipilimumab并没有显示出强烈的副作用【图4D】。

此外,研究者还发现这种免疫治疗诱导的副作用,和全身的T细胞激活相关,特别是自我反应性T细胞中调节性T细胞(Treg)和效应T细胞(Teff)的比例起决定性的作用。这项研究表明,抗CTLA-4抗体的抗肿瘤效果和免疫治疗副作用的产生并不一定是相伴相随的,因为它们的分子机制是不一样的(一个依赖于肿瘤局部Treg的删除,一个依赖于自体反应性T细胞的扩增和全身T细胞的激活, 【图5】)。


图5. 抗CTLA-4抗体在免疫治疗诱导的副作用(irAE,immunotherapy related adverse events )和 癌症免疫治疗效果(CITE,cancer immunotherapeutic effect)中有着截然不同的分子机制。 irAE是外周淋巴器官中自体反应性T细胞的多克隆扩增造成的,主要是通过抑制自身反应性T细胞转化成自身反应性Treg细胞。 CITE引起的肿瘤排斥是通过FcR介导的特异性清除肿瘤微环境中的Treg细胞来实现的,并且此过程独立于外周淋巴器官中天然T细胞的活化。此外,irAE和CITE都不依赖于对CTLA-4/B7相互作用的阻断。(摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z)

刘阳/郑盼教授联合实验室的一系列突破性研究成果,进一步阐明了抗CTLA-4抗体的抗肿瘤分子机制,提供了有效的评价抗CTLA-4抗体药物安全性的小鼠模型,并初步筛选到相对于Ipilimumab更加安全的抗CTLA-4抗体克隆株HL12和HL32,这些研究对今后第3代抗CTLA-4抗体以及以CTLA-4为靶点的其它类型药物的研发有着重要的指导意义。

据悉,本研究完成于美国国立儿童医学中心的癌症与免疫学研究中心。杜雪相博士、唐飞博士和刘明月博士为两篇论文的共同第一作者,刘阳教授和郑盼教授为共同通讯作者。

参考文献:

Keler, T. et al. Activity and safety of CTLA-4 blockade combined with vaccines in cynomolgus macaques. J. Immunol. 171, 6251–6259 (2003).

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Hellmann, M. D., et al. Nivolumab plus Ipilimumab as first-line treatment for advanced non-small-cell lung cancer (CheckMate 012): results of an open-label, phase 1, multicohort study. Lancet Oncol. 18, 31–41 (2017).

Weber, J., et al. Adjuvant Nivolumab versus Ipilimumab in resected stage III or IV melanoma. N. Engl. J. Med. 377, 1824–1835(2017).

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