免疫肿瘤学研究新发现:PD-L1的糖基化和三阴性乳腺癌的免疫治疗
生物探索 · 2018/01/19
本讲座通过研究三阴性乳腺癌细胞的PD-L1的糖基化和稳定性,探索了用单克隆抗体阻断“免疫逃逸”的机制,及研发出新的“抗体和药物结合物(ADC)”来治疗三阴性乳腺癌。

一、前言

 

几十年来癌症的治疗一直受到了科学家的极大关注。乳腺癌的治疗在过去20年内得到了极大程度的发展,虽然该疾病的死亡率大幅度降低,但该疾病的发病率仍然非常高。在各类乳腺癌中,“三阴性乳腺癌”因为缺少治疗靶标(如雌激素受体、孕酮受体和人表皮生长因子受体2),一直是治疗的难点。令科学家感兴趣的是:“三阴性乳腺癌”肿瘤里具有最多的肿瘤浸润性淋巴细胞,这些淋巴细胞被推测有助于抵抗肿瘤生长,然而三阴性乳腺癌会使肿瘤中的淋巴细胞沉默或失活。这也给我们一个提示,对于三阴性乳腺癌,如果我们使用免疫治疗方法激活杀伤肿瘤的淋巴细胞活性,将会是一个新的治疗策略

 

二、什么是免疫抑制机制

 

该讲座先介绍了最重要的一种免疫抑制机制,即“PD-L1和PD-1作用机制”。癌细胞在细胞表面表达PD-L1,PD-L1将会链接T细胞的PD1,这种关联将最终关闭T细胞的活性,也就是发生“免疫逃逸”。科学家现在开发了单克隆抗体,可以专一性地识别癌细胞上的PD-L1或T细胞上的PD-1。这种策略将有助于掩盖这两种分子的相互作用的表面,因此可以阻断PD-L1和PD-1的链接,从而重新激活T细胞的活性,允许T细胞识别癌细胞,然后清除这些它们。目前,这类治疗的整体响应率在大概20%-40%。演讲者判断“三阴性乳腺癌”一定存在类似的免疫抑制机制。

 

 

图1.PD-L1和PD-1作用机制

 

本讲座通过研究三阴性乳腺癌细胞的PD-L1的糖基化和稳定性,探索了用单克隆抗体阻断“免疫逃逸”的机制,及研发出新的“抗体和药物结合物(ADC)”来治疗三阴性乳腺癌。

 

三、实验方法及结果

 

演讲者先研究了癌细胞上的PD-L1,想弄明白PD-L1表达在癌细胞的哪个部位?因为PD-L1的分子量为33千道尔顿,而Western Blot实验表明,33千道尔顿的蛋白质表达是非常少的,而50千道尔顿的蛋白质表达非常多。经过一系列的基因敲除实验,证实这个高分子量的蛋白就是PD-L1信号,是高度糖基化的PD-L1。用突变方法发现PD-L1只在其细胞外区域的4个NXT结构域上发生了糖基化。

 

为了验证糖基化的PD-L1和PD-1的相互作用,演讲者使用IncuCyte活细胞动态成像系统对PD-L1和PD-1之间的动态变化进行定量。向有糖基化PD-L1的癌细胞(红色核标记)溶液中加入绿色荧光标记的PD-1蛋白质,在处理后12个小时的时候,细胞表面有大量的绿色聚集,说明PD-L1和PD-1有相互作用。而对于非糖基化的PD-L1的稳定克隆,并没有看到很多的绿色荧光,这意味着PD-L1和PD-1在12个小时之后没有相互作用。结果显示这个糖基化结构是蛋白相互作用所必须的。

 

 

图2.用IncuCyte成像仪对PD-L1和PD-1之间的动态变化进行定量

 

为了理解糖基化的功能,演讲者再次使用IncuCyte成像仪来模拟T细胞存在时癌细胞和T细胞的动态相互作用。在此例中,对于BT549核IP细胞,加入活化的T细胞,共同孵育5天时间,用表示Caspase 3活性的绿色荧光表示癌细胞的凋亡。只要癌细胞开始死亡,就可以看到红色荧光的减弱和绿色荧光的增强。结果表明:糖基化PD-L1的癌细胞对T细胞杀伤具有抵抗作用,而非糖基化的癌细胞对T细胞杀伤非常敏感。

 

 

图3.用IncuCyte成像仪来模拟T细胞存在时癌细胞和T细胞的动态相互作用

 

下一步,演讲者想了解调控糖基化的上游信号是什么?他们将两种三阴性乳腺癌细胞BT549和BT468,用不同的刺激物,如EGF,IGF,HGF,FGF和TGFβ处理。发现EGF可以一致地诱导两种三阴性乳腺癌细胞的PD-L1的糖基化。糖基化的PD-L1很稳定,而非糖基化的PD-L1半衰期很短。上游信号EGF,可以增加PD-L1的糖基化形式。所以如果我们抑制EGFR信号,我们就可以使同源动物模型中的三阴性乳腺癌细胞对“抗-PD-1”的治疗敏感。

 

另一个发现是:三阴性也会诱发慢性的炎症。他们想了解为什么这些炎症会引起癌症的发展。演讲者发现,在肿瘤微环境中,巨噬细胞具有分泌TNFα(肿瘤坏死因子α)的能力,而TNFα会识别癌细胞的TNFα受体。TNFα将活化NF-kappaB,并且引起p65的核转移,然后开启CSN5的表达。CSN5是一种泛素化酶,该酶将稳定PD-L1,诱导癌细胞的免疫抑制功能,促进癌细胞的发展。

 

演讲者与药厂合作,开发抗糖基化PD-L1的抗体。他们将糖基化的PD-L1作为抗原接种在小鼠上,创造了3,000个杂交瘤克隆。然后用流式细胞仪筛选这3,000个克隆,努力寻找能特异性识别糖基化PD-L1,而不识别非糖基化PD-L1的抗体。然后用IncuCyte成像仪进一步揭示哪个抗体具有阻断PD-L1和PD-1相互作用的功能。他们使用了Essen BioScience的技术和pHrodo吞噬系统,来研究抗体是否能结合糖基化的PD-L1,然后诱导这个PD-L1的内部化,并进入溶酶体被细胞降解。演讲者将STM108抗体用荧光染料标记上荧光。当细胞开始吞噬这些抗体时,IncuCyte成像仪中将会观察到红色荧光。在此例中,当他们将STM108抗体加入PT549的稳定克隆中时,可以看到在12个小时的过程中能诱导出很漂亮的红色荧光,暗示STM108抗体可以特异性地内化到癌细胞中去。然后在处理5天之后做了Western Blot,可以发现大量的PD-L1减少了,暗示PD-L1发生了降解

 

 

图4.用IncuCyte成像仪观察pHrodo吞噬系统,暗示STM108抗体可以特异性地内化到癌细胞中去。

 

演讲者又研究了抗体和药物结合技术,挑选MMAE作为弹头,将细胞毒性的药物结合到抗体上。当小鼠具有PD-L1表达,用“抗体药物结合物(ADC)”处理之后,它们的肿瘤生长发生了显著降低。当用糖基化ADC抗体处理之后,4T1-hPDL1肿瘤也不再生长。当小鼠用糖基化的MMAE抗体处理后,可观察到肿瘤微环境中产生强烈的红色荧光,表示Caspase 3的活性增加,细胞发生凋亡。一旦发生内吞事件,PD-L1蛋白将进入溶酶体并被降解,随着抗体和PD-L1的降解,针对癌细胞的细胞毒性药物就会被释放,然后杀伤PD-L1高表达的癌细胞。这也会产生“旁观者效应”,可清除不表达PD-L1的癌细胞。

 

 

图5.观察肿瘤微环境中的红色荧光,表示Caspase 3的活性增加

 

四、结论

 

基于他们的信号分析,演讲者可以设计策略,努力分离能特异性识别糖基化PD-L1的单克隆抗体。他们第一次发现这个抗PD-L1抗体可以交联结合在膜上的“PD-L1”分子,并且诱导这个蛋白的内吞作用,因此可以让抗体携带细胞毒性药物,通过内吞释放该药物,杀死癌细胞,引发对三阴性乳腺癌的深远的疗效。

 

五、自动化的活细胞动态分析   

 

目前,大部分的细胞检测方法仍然属于传统的终点法——仅仅给出最终结果,这种方法不仅无法对细胞实验的全过程做出动态的监测和分析,还可能得到有偏差的结果。为了能够全程的观测活细胞,美国Essen公司开发了内置于培养箱的IncuCyte S3“活细胞动态成像与分析系统”,在培养箱内部,同时对6块细胞培养皿/瓶/微孔板(6-384孔)进行长时间的动态成像,记录细胞形态细节的实时改变,并通过功能强大的图像分析软件转化为多种细胞功能相关的时间定量曲线。

 

IncuCyte是细胞水平的科研与药物筛选解决方案,已用于免疫肿瘤杀伤、神经生长及退行、癌细胞转移、细胞迁移、干细胞分化、细胞凋亡、细胞坏死、细胞增殖、伤口修复等应用的大规模筛选与长时程生命科学问题的研究。


 

图6. IncuCyte S3活细胞动态成像与分析系统

 

六、在线讲座视频   

 

视频时长1hr8min,请在WiFi条件下观看:

https://v.qq.com/x/page/n05302ljxpr.html

  

七、关于“典奥生物科技”   

 

“典奥生物科技”(上海、香港、台湾)成立于1994年,二十多年来一直坚持以国际一流仪器生产商为背景,具有丰富研发经验的专家为技术支持,专业的维修团队为服务后盾,专注于为生命科学、医药研发和疾病治疗领域,提供最先进的软硬件设备和技术服务。

 

“典奥生物科技”独家总代理的仪器有:

IncuCyte、Beacon、Chipcytometry、Gyrolab、iQue Screener PLUS、Avatar、PlexBio、Certus、HighRes等。

 

电话:021-58605185(转市场部)

Email:marketing@tekon.com.cn

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