如何动态观测并定量iPSC来源的神经细胞?
生物探索 · 2018/01/19
本讲座讲述了用IncuCyte“活细胞动态成像与分析系统”,对“人诱导多能干细胞(iPSC)来源的神经细胞”进行活细胞定量分析。包括如何优化您的培养条件和评估细胞健康性,或通过进行多重实验,检测神经毒性化合物引起的神经突生长的变化。

一、前言

研究人类疾病对神经系统影响的一个主要局限在于是否具备培养、监控和分析神经细胞的能力,以准确表现这些疾病的表型。研究人诱导多能干细胞(hiPSC)来源的神经细胞为神经疾病的模型化提供了新的研究方法。如何在长期培养中监控神经元的形态和细胞健康性是描述和评估这些新型模型系统的关键。而依赖于终点法的传统实验/成像技术,需要免疫化学染色,且只能提供有限的实时动态信息。在本次在线讲座中,我们展示了IncuCyteS3用于人iPSC来源的神经细胞的长期动态定量分析的研究方法。

 

二、讲座简介

本讲座讲述了如何利用IncuCyte“活细胞动态成像与分析系统”优化人iPSC来源的神经细胞的培养条件;如何用相差成像(单独培养)或荧光成像(共培养)进行实时活细胞分析;如何利用NeuroTrack软件对神经突的动态变化进行成像和定量;如何将其他活细胞表型实验(如“细胞凋亡”)用于监测神经细胞健康性并验证其活动机制。


图1. 讲座标题


三、实验方法

我们的实验分为单一培养和共培养。

3.1用单一培养研究培养条件优化和iPSC来源的神经细胞在培养板上的粘附

我们将神经细胞(iCell GabaNeurons)接种在PDL,PLO或PEI上,培养板分别用或不用基质胶(Matrigel)或层粘连蛋白(Laminin)进行二次包被。然后放入IncuCyte S3,用相差 NeuroTrack软件分析进行神经突长度随时间生长的定量。

 

3.2用共培养研究神经毒性化合物的影响

采用谷氨酸神经细胞(iGlutaNeuron)和原代大鼠星形胶质细胞共培养体系,将神经细胞在第1天(DIV0)铺板,加入IncuCyteNeuroLight Red试剂进行红色慢病毒转染并放入IncuCyte S3中;在第2天(DIV1)移除这些试剂,将星形胶质细胞铺板,再次放入IncuCyte S3中,用荧光NeuroTrack算法跟踪神经突的生长。在第15天(DIV14)时加入神经毒性化合物,或化合物及其受体拮抗剂,再加入监测细胞凋亡的Annexin Green试剂进行多重反应,随后监控72hr。

 

四、实验结果

4.1 用单一培养研究培养条件优化和iPSC来源的神经细胞在培养板上的粘附

无论是否存在额外的基质胶或层粘连蛋白的包被,种植在PDL或PLO上的细胞都形成了大的神经细胞球。但存在基质胶或层粘连蛋白包被时,与单独使用PDL或PLO相比,神经突生长更多。对于种植在PEI上的细胞,在PEI和层粘连蛋白的共同包被下,神经突的生长更稳健,覆盖率也增加了(图2)。


图2. 左侧图像显示:在DIV3时刻,在PEI和层粘连蛋白(PEI+laminin)的共同包被下,神经突的生长更稳健;在DIV14时刻,在PEI和层粘连蛋白(PEI+laminin)的共同包被下,神经突的覆盖率也增加了。右侧图表中,蓝色线表示PEI+层粘连蛋白,红色线表示单独的PEI,蓝色线表示的神经突长度随时间的增加比红色线更快。

 

4.2用单一培养和共培养分别研究神经毒性化合物的影响

我们将研究兴奋性毒性,研究神经毒性化合物谷氨酸盐(Glutamate)和红藻氨酸盐(Kainate),是如何影响神经突的生长。

 

对谷氨酸神经细胞(iGlutaNeuron)单独培养体系,我们用细胞核标记物(IncuCyte NeuroLight Red红色慢病毒试剂)标记活的神经细胞,用IncuCyteS3对神经突生长进行14天的监控,头14天神经突长度随时间明显增加。在第15天,我们以不同的浓度加入了谷氨酸盐。谷氨酸盐引起了浓度依赖性的神经突长度的减少,该现象被谷氨酸盐受体拮抗剂NBQX和MK801所抑制(图3A上两张图)。我们又加入了监测细胞凋亡的Annexin Green试剂进行多重反应,凋亡细胞将被染上绿色荧光。在谷氨酸盐处理之后,谷氨酸盐浓度的增加可以引起Annexin Green试剂的信号的增加,说明细胞凋亡增加,该现象也被谷氨酸盐受体拮抗剂NBQX和MK801所抑制(图3A下两张图)。

 

加入红藻氨酸盐也可以得到与加入谷氨酸盐相类似的结果:加入红藻氨酸盐可引起浓度依赖性的神经突长度的减少和AnnexinGreen试剂的信号的增加,这个趋势也可以被谷氨酸盐受体拮抗剂NBQX和MK801所抑制(图3B)。


图3. iGlutaNeuron神经细胞单独培养。左侧A部分表示谷氨酸盐(Glutamate)的神经毒性作用:上左图在DIV14时刻加入谷氨酸盐,神经突长度减少,谷氨酸盐浓度越高,神经突长度减少得越厉害。上右图在DIV14时刻同时加入谷氨酸盐及谷氨酸盐受体拮抗剂(Antagonist),神经突长度减少的趋势得到缓解。下左图表示谷氨酸盐可引起Annexin Green试剂的信号的增加,谷氨酸盐浓度越高,信号增加越多。下右图表示AnnexinGreen试剂的信号的增加也可以被谷氨酸盐受体拮抗剂所抑制。右侧B部分表示红藻氨酸盐(Kainate)的神经毒性作用:实验结果与A部分谷氨酸盐相似。

 

在谷氨酸神经细胞和原代大鼠星形胶质细胞共培养体系中,我们也研究了神经毒性化合物谷氨酸盐和红藻氨酸盐,是如何影响神经突的生长的,并得到了相似的结论(图4)。

 

图4. iGlutaNeuron神经细胞和星形胶质细胞共培养。解释同图3。

 

该过程也有图像作为佐证,如加入红藻氨酸盐之后的72hr,可以观察到AnnexinGreen试剂的信号(绿色荧光)的增加和显示神经突长度的红色荧光的减弱(图5)。


图5. 加入红藻氨酸盐之后的72hr,与对照(左图)相比,可以观察到Annexin Green试剂的信号(绿色荧光)的增加和显示神经突长度的红色荧光的减弱(右图)。

 

总结而言,该讲座展示了如何用IncuCyte S3进行动态细胞分析,并有录像提供真正有价值的直观信息并验证了实验得到的定量数据,极大地推进了对生物学研究的洞察。

 

五、自动化的活细胞动态分析   

 

目前,大部分的细胞检测方法仍然属于传统的终点法——仅仅给出最终结果,这种方法不仅无法对细胞实验的全过程做出动态的监测和分析,还可能得到有偏差的结果。为了能够全程的观测活细胞,美国Essen公司开发了内置于培养箱的IncuCyte S3“活细胞动态成像与分析系统”,在培养箱内部,同时对6块细胞培养皿/瓶/微孔板(6-384孔)进行长时间的动态成像,记录细胞形态细节的实时改变,并通过功能强大的图像分析软件转化为多种细胞功能相关的时间定量曲线。

 

IncuCyte S3是细胞水平的科研与药物筛选解决方案,已用于免疫肿瘤杀伤、神经生长及退行、癌细胞转移、细胞迁移、干细胞分化、细胞凋亡、细胞坏死、细胞增殖、伤口修复等应用的大规模筛选与长时程生命科学问题的研究。


图6. IncuCyte S3:活细胞动态成像与分析系统

 

六、在线讲座视频   

 

视频时长22min,请在WiFi条件下观看:

https://v.qq.com/x/page/y0513k5eicg.html

 

 

七、关于“典奥生物科技”   

 

“典奥生物科技”(上海、香港、台湾)成立于1994年,二十多年来一直坚持以国际一流仪器生产商为背景,具有丰富研发经验的专家为技术支持,专业的维修团队为服务后盾,专注于为生命科学、医药研发和疾病治疗领域,提供最先进的软硬件设备和技术服务。

 

“典奥生物科技”独家总代理的仪器有:

IncuCyte、Beacon、Gyrolab、Chipcytometry、iQue Screener PLUS、Avatar、PlexBio、Certus、HighRes等。

 

电话:021-58605185(转市场部)

Email:marketing@tekon.com.cn

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