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女神又1篇Nature!找到“关键”,让CRISPR达到前所未有的精准度

2017/09/23 来源:生物探索
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导读
7月1篇Science、8月1篇Cell的CRISPR女神Jennifer Doudna教授本月最新发表了1篇Nature。该研究中,科学家们鉴定出了Cas9蛋白中的一个关键区域;通过调节这一区域,有望产生了一个超精准的、具有最低脱靶切割水平的基因编辑工具。这一成果将帮助克服阻碍CRISPR用于疾病治疗的“脱靶效应”。


图片来源:网络

9月20日,发表在最新一期Nature杂志上题为“Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy”的研究中,来自加州大学伯克利分校、麻省总医院等机构的研究者们鉴定出了Cas9蛋白中的一个关键区域。通过调节这一区域,有望产生了一个超精准的、具有最低脱靶切割水平的基因编辑工具。CRISPR先驱Jennifer Doudna教授是这篇论文的通讯作者。

先前成果

5年前,Doudna教授与现任Max Planck研究所感染生物学部主任的Emmanuelle Charpentier教授在Science杂志上发表了一篇题为“A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity”的重要成果,首次揭示了CRISPR/Cas9这一天然免疫系统的基因组编辑功能。此后,科学家们一直在追求降低这一技术的脱靶编辑(即,编辑了预想之外的基因)。因为,提高CRISPR/Cas9的准确度对基础研究,以及基因编辑的临床应用非常重要。

当前,利用CRISPR-Cas9技术的研究人员首先需要构建一个sgRNA(single-guide RNA)。sgRNA中包含一段与目标DNA匹配的序列,被附着在Cas9酶上。将Cas9-sgRNA复合物引入到目标细胞后,sgRNA会找到与其匹配的DNA序列,然后,Cas9酶结合目标DNA序列,切断双链。不过,正如前文所说,Cas9-sgRNA复合物也会导致不受欢迎的脱靶切割。


图片来源:网络

在过去的两年里,有研究小组设计出了“升级版的Cas9蛋白”,包括eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1。Doudna教授及其小组成员一直在探索为什么“升级版的Cas9蛋白”能够比已被广泛应用的、来自酿脓链球菌的野生型Cas9蛋白实现更精确的切割。


图片来源:Nature

最新发现

在最新发表的这项研究中,科学家们利用一种被称为单分子FRET((Förster resonance energy transfer)的技术,来精准测量当Cas9-sgRNA复合物结合DNA后,这种复合物中不同的蛋白质域(protein domain),尤其是REC3、REC2 和HNH究竟是如何移动的。


The Cas9 protein (gray) is an RNA-guided nuclease that can be programmed to bind and cut any matching DNA sequence (dark blue double helix), making it a powerful tool for genome engineering. Upon target binding, Cas9 protein domains undergo conformational rearrangements (the motions of individual amino acids are represented by rocket tails) to activate the Cas9-sgRNA complex for target cleavage. The REC3 domain (teal) is responsible for target sensing, which signals the outward rotation of the REC2 domain (magenta) to open a path for the HNH nuclease domain (yellow). This active conformation of Cas9 is then capable of triggering concerted cleavage of both strands of the target DNA. (Janet Iwasa graphic)

首先,他们发现,Cas9突变体的HNH构象开关的阈值比野生型Cas9的相应值要高得多,这使得当结合到非目标序列时,eSpCas9(1.1) 和 SpCas9-HF1这两种突变体更不容易激活它的“剪刀作用”。

接下来,研究者们发现,REC3域负责感知靶向结合(target binding)的准确性,然后向REC2域发出信号,让其为HNH核酸酶域打开一条通路,最终激活Cas9的“剪刀作用”。

随后,研究还证实,通过让REC3发生部分突变能够改变Cas9蛋白的特异性,使得除非sgRNA和目标DNA非常匹配,否则HNH核酸酶域不会被激活。在这一研究中,科学家们设计出了一种改良版的、超精确的(hyper-accurate)Cas9——HypaCas9。研究证实,HypaCas9保持了它的“中靶”(on-target)效率,且区分人类细胞中目标位点和脱靶位点的能力略有提高。

该研究的共同第一作者、Doudna 教授实验室的研究生Janice Chen说:“我们发现,Cas9酶的REC3域(REC3 domain of Cas9)中微小的改变就会影响‘中靶编辑’(on-target editing,正确编辑了目标DNA)和脱靶编辑之间的差异。”


Janice Chen(图片来源:Doudna lab)

未来期望

研究人员认为,作为DNA切割的主要控制器,他们所鉴定出的这一蛋白质域无疑是用来进一步改善CRISPR准确性的一个非常明显的“目标”。重新设计这一区域有望帮助科学家们“定制”Cas9的突变体,从而最小化CRISPR/Cas9编辑错误区域DNA的机会,克服阻碍这一技术用于疾病治疗的“脱靶效应”。

通过继续探索Cas9的结构、功能和动力学之间的关系,Doudna教授和她的团队希望能进一步设计出一种具有精妙敏感性的Cas9蛋白,实现更加可靠、有效的基因编辑。

其它论文

作为CRISPR先驱,Doudna教授在CNS上发表论文可谓是“家常便饭”。今年7月发表在Science杂志上题为“Structures of the CRISPR genome integration complex”的研究中,她的团队揭秘了CRISPR蛋白Cas1-Cas2是如何找到它们的目标的。研究证实,Cas1-Cas2对插入位点的识别并不是依赖序列,而是依赖结构。【详细

而刚刚过去的8月,“女神”团队又在Cell杂志上发表了一篇题为“A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9”的论文,找到了CRISPR-Cas9系统的一种广谱抑制剂,也就是“关闭开关”。这项成果将为阻止不法的、失控的CRISPR应用提供了手段,帮助提高CRISPR技术的安全性。【详细

参考资料:

Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy

Discovery helps engineer more accurate Cas9s for CRISPR editing

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