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Cell:重磅!利用改进的CRISPR/Cas9系统校正微卫星重复扩增疾病中的RNA缺陷

2017/08/27 来源:生物谷
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导读
在一项新的研究中,这些研究人员将RCas9又向前推进一步:他们利用这种技术校正导致微卫星重复扩增疾病(microsatellite repeat expansion diseases)的分子错误。


本文转载自“生物谷”。

在此之前,CRISPR-Cas9基因编辑技术仅能够被用来操纵DNA。在2016年的一项研究中,美国加州大学圣地亚哥分校医学院的研究人员在一种被称作RNA靶向性Cas9(RNA-targeting Cas9, RCas9)的方法中改变这种技术的用途,利用它追踪活细胞中的RNA(Cell, doi: 10.1016/j.cell.2016.02.054)。在一项新的研究中,这些研究人员将RCas9又向前推进一步:他们利用这种技术校正导致微卫星重复扩增疾病(microsatellite repeat expansion diseases)的分子错误。相关研究结果于2017年8月10日在线发表在Cell期刊上,论文标题为“Elimination of Toxic Microsatellite Repeat Expansion RNA by RNA-Targeting Cas9”。微卫星重复扩增疾病包括1型肌强直性营养不良、2型肌强直性营养不良、最为常见的遗传性肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和亨廷顿舞蹈病。

论文通信作者、加州大学圣地亚哥分校医学院细胞与分子医学教授Gene Yeo博士说,“这是激动人心的,这是因为我们不仅靶向当前缺乏延缓病情恶化的疗法的疾病的根源,而且我们我们重新改造了这种CRISPR-Cas9系统,从而使得通过一种病毒载体将它运送到特定组织中成为可能。”

在生物学中心法则中,编码在细胞核DNA中的基因先经过转录产生mRNA,随后mRNA进入细胞质中,在那里,它们经过翻译产生蛋白。

微卫星重复扩增疾病是由于RNA序列发生错误的重复而产生的,这些重复对细胞是有毒性的,这部分上是因为它们阻止至关重要的蛋白产生。这些重复性RNA在细胞核或细胞质中聚集,形成病灶(foci)。

在这项概念验证的研究中,Yeo团队在实验室在来自患者的细胞和细胞疾病模型中,利用RCas9清除了与微卫星重复扩增疾病相关联的重复性RNA。

在正常情形下,CRISPR-Cas9的工作机制是:设计一种“向导RNA(gRNA)”,这种gRNA与一个特定的靶基因的序列相匹配。这种gRNA引导Cas9酶到基因组中的靶位点上,Cas9在那里进行切割。细胞不精确地修复DNA断裂,因而让这个基因失活,或者利用这个基因的正确版本替换切割位点附近的DNA片段。RCas9类似地发挥作用,但是gRNA引导Cas9到RNA分子上而不是到DNA上。

这些研究人员在实验室针对导致微卫星重复扩增疾病的RNA测试了这种新的RCas9系统。RCas9清除了95%以上的与1型肌强直性营养不良、2型肌强直性营养不良、最为常见的ALS和亨廷顿舞蹈病相关的RNA病灶。这种方法也清除了95%的在实验室培养的患者肌强直性营养不良细胞中存在错误的重复性RNA。

另一种衡量成功的指标在于MBNL1。MBNL1是一种在正常情形下结合到RNA上的蛋白,但是1型肌强直性营养不良中的RNA病灶阻止它结合到它的上百种天然的RNA靶标上。当这些研究人员采用RCas9时,他们在患者肌肉细胞中逆转了93%的存在功能障碍的RNA靶标,而且这些细胞最终类似于健康的对照细胞。

Yeo解释道,尽管这项研究提供初步证据证实这种方法在实验室中有效果,但是在RCas9能够在患者中进行测试之前,还有很长的路要走。

一种瓶颈是运送RCas9到患者细胞中的效率。非传染性腺相关病毒(AAV)经常用于基因疗法之中,但是它们太小而不能够运送Cas9到靶DNA上。Yeo团队通过剔除Cas9蛋白中进行DNA切割所必需的片段但保留RNA结合不可缺少的片段,构建出一种更小的Cas9版本。

他说,“我们迄今为止并不知道的是这种运送RCas9到细胞中的病毒载体是否会引发免疫反应。在人体中测试这一点之前,我们需要在动物模型中进行测试,确定潜在的毒性和评估长期接触的安全性。”

为此,Yeo和同事们成立一家被称作Locana的衍生公司来处理将RCas9从实验室转移到针对基于RNA的疾病(如微卫星重复扩增疾病)开展的临床试验所必需的临床前步骤。

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