表征确证 | 多肽和蛋白质的等电点检测方法
APT官网 · 2017/08/24
等电点是蛋白质最基本和重要的理化参数,同时也是生物药质量控制的一个重要方面。

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等电点是蛋白质所带净电荷为零时所处环境的pH。一个蛋白的等电点跟它的氨基酸序列和翻译后修饰相关,它是蛋白质最基本和重要的理化参数,同时也是生物药质量控制的一个重要方面。那您是否了解检测特定蛋白质的等电点呢?又该如何选择合适的等点电的测试方法呢?今天小编就带您一起飞!


常用的检测等电点的方法有聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦(由于常用的电泳设备是Multiphor II flatbed system,所以又称平板等电聚焦)和毛细管等电聚焦。这两种方法均被药典收录,分别见2015年中国药典第四部通则0541第六法和通则0542。下面细述一下这两种方法的分析原理、对样品的上机前处理、操作方法及各自的适用性等。


平板等电聚焦

总体评价:分辨率低,操作繁琐,仪器设备相对便宜。


相信您一定听过双向电泳,其中第一向就是聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦。它是在凝胶制备时加入两性电解质,通电后凝胶内会形成pH梯度,蛋白质在小于其等电点的pH中带正电荷,在电场的作用下会向负极移动,当到达某一pH值时,蛋白所带净电荷为零,蛋白质不再移动,此处的pH值即为该蛋白质样品的等电点。


图1 等电聚焦电泳仪-Multiphor II Electrophoresis System (GE)


图2 等电聚焦 (Principles of Biochemistry, Lehninger)


等电聚焦结束后,对凝胶进行考染或者银染,然后通过与标准品对比后进行定量计算,获取蛋白质样品的等电点参数。平板等电聚焦不适用于分子量过大的样品,如融合蛋白疫苗,病毒样颗粒。

 

由于电泳时,电压可达到几千伏,容易出现因迁移阻力造成电阻多大,而产热过多出现胶条烧焦的现象。所以等电聚焦过程中需控制样品的盐浓度,否则易出现烧胶、断胶。另外,样品缓冲液中的盐离子对条带的形状影响较大,因此样品分析前应进行脱盐处理。

现在经常电话咨询胶条跑胶时烧焦了的童鞋知道了吧。不管是双向电泳还是一向的等电聚焦实验,样品缓冲液一定要低盐,否则不仅迁移效果容易收到干扰,更可能造成产热过高而烧焦的现象。下面就是一张火辣辣的例子,大家自行观看。




平板等电聚焦所用的仪器是Multiphor II Electrophoresis System,不过最近在GE的官网上看到一个令人震惊的消息:这货已经停产了!如此看来毛细管等电聚焦是大势所趋啊~



毛细管等电聚焦(cIEF)

总体评价:分析时间短,分辨率高,仪器设备昂贵。


分离原理同上。明显不同于平板等电聚焦的是:分离介质是毛细管柱,检测器是UV 280。该方法应用最广泛的两款仪器分别是: PA800 Plus (Beckman) 和iCE3 (Protein Simple)。


图3 毛细管内的pH梯度(PA800 Plus cIEF Application Guide)


cIEF包含聚焦和迁移两个步骤。进样后整个毛细管充满两性电解质、稳定剂、pI Markers以及供试品蛋白。通过在毛细管两段加上电压,两性电解质形成pH梯度,蛋白样品在检测窗口之前完成聚焦(此过程一般要15min)。在压力或者化学作用下,聚焦完成的样品迁移通过检测窗口(此过程一般要30min)。在迁移过程中,谱带易受到流体动力流的影响而变宽。

而另外一种使用iCE3和iCE280的cIEF-全柱成像毛细管等电聚焦,则很好的解决了谱带变宽的问题。它通过用UV280检测器对整个毛细管内的等电聚焦过程进行在线监测,省去了迁移这一步骤,缩短了分析时间。


由于高盐会影响聚焦条件,损坏毛细管涂层,因此cIEF上机分析也需要对样品进行脱盐处理,确保盐浓度不能高于50mM。

cIEF不适用:无UV280吸收的样品


以上是关于等点电检测的一些知识,希望能对大家有所帮助,如有疑问可以直接留言或评论联系我们!


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