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Nature Methods:全面检测CRISPR脱靶效应的新策略

2017/05/08 来源:生物通/薄荷
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导读
CRISPR/Cas9基因组编辑目前正应用得如火如荼,但若要转化到临床应用,准确检测脱靶效应则是必不可少的。近日,麻省总医院的研究人员开发出一种新策略,能够鉴定全基因组范围的CRISPR/Cas9脱靶突变。


本文转载自“生物通”。

CRISPR/Cas9基因组编辑目前正应用得如火如荼,但若要转化到临床应用,准确检测脱靶效应则是必不可少的。近日,麻省总医院的研究人员开发出一种新策略,能够鉴定全基因组范围的CRISPR/Cas9脱靶突变。

之前,在全基因组范围鉴定脱靶效应的细胞方法也时有报道,但这些方法可能错过低频率的脱靶突变,而且高效转染的要求也限制了其应用。相比之下,体外筛查策略则具有一定的优势。它不需要高效转染,避免了细胞适应性的影响。此外,活性核酸酶的浓度可以尽可能高,将低频率突变一网打尽。

在这篇周一发表于《Nature Methods》的文章中,麻省总医院和哈佛大学的研究人员介绍了一种新的体外筛查方法CIRCLE-seq。他们认为,这种方法在鉴定全基因组的CRISPR/Cas9脱靶突变上,比现有的细胞或生化方法表现更佳。

“与之前的体外方法相比,我们表明CIRCLE-seq可使用广泛普及的新一代测序技术,且不需要参考基因组序列,”作者在文中写道。重要的是,这种方法可以鉴定与细胞类型特异的单核苷酸多态性相关的脱靶突变,证明了它有望生成个性化的特异性图谱。总之,CIRCLE-seq为鉴定全基因组范围的脱靶突变提供了一种快速全面的方法。

在这项研究中,研究人员设计了不依赖限制性内切酶的策略,将随机剪切的DNA转化为两种不同类型的共价闭合DNA结构:将茎环连接到线性DNA末端,或将线性片段环化。他们发现,在富集Cas9核酸酶切割的基因组DNA片段时,环化策略的效率比连接策略至少高了一个数量级。

随后,研究人员检测了新方法的灵敏度。他们获得了针对HBB基因的向导RNA的脱靶结果,并将这个图谱与另一种鉴定方法(Digenome-seq)获得的图谱进行比较。他们发现,CIRCLE-seq鉴定出Digenome-seq所发现的29个脱靶位点中的26个,同时还发现了156个新位点。

“这些结果表明,与Digenome-seq相比,CIRCLE-seq具有更高的信噪比,且需要的测序reads少了100倍。在鉴定全基因组的脱靶位点时,它有望实现更高的灵敏度,”作者写道。

在同一期的杂志上,Caribou Biosciences和DuPont Pioneer的研究人员介绍了另一种名为SITE-Seq的生化方法,它利用通过向导RNA编程的Cas9来鉴定基因组内的切割位点

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