伯豪客户Nature子刊解析与癌症相关的lncRNA
2017/04/20
肝癌细胞(HCC)经常侵入门静脉系统并且发展成为门静脉肿瘤血栓(PVTT)。长脸非编码RNA是一类不能够编码蛋白质,并且长度大于200bp的具有生物学功能的RNA。有研究报道,其对肝癌发生具有重要影响。

研究背景

      肝癌细胞(HCC)经常侵入门静脉系统并且发展成为门静脉肿瘤血栓(PVTT)。长脸非编码RNA是一类不能够编码蛋白质,并且长度大于200bp的具有生物学功能的RNA。有研究报道,其对肝癌发生具有重要影响。但是其具体的关联却并还没有详细的研究。在此,清华大学联合上海东方肝胆医院研究人员通过对20个病人的60个临床样本进行RNA-Seq鉴定到了8603个可能的lncRNA。其中917个lncRNA在TCGA数据库以及发表的肝癌数据库中有关联,235个lncRNA存在CNVs和DNA甲基化变化。很多与lncRNA共表达的基因富集在细胞粘着、免疫反应以及代谢过程等通路上。HAND2-AS1还通过RNAi的敲降进行了部分功能研究。因此,可以说研究人员对lncRNA在肝癌的肿瘤发生与转移过程中提供了有用的资源。

研究思路


研究结果

鉴定临床样本中肝癌细胞的lncRNA

      为了系统鉴定肝癌发生与转移细胞中的lncRNA,研究人员收集了20个临床病人的60歌样本进行了全转录组的RNA测序(该服务由伯豪生物提供)。其中,每个病人分别收集原发灶、临近的正常组织以及PVTT样本。一共鉴定到了20345个蛋白编码基因,13870个GencodeV19鉴定的lncRNA以及8603个新的lncRNA。分析流程如图1。


图1: 数据分析流程。

候选lncRNA的鉴定

      对这些新的lncRNA在基因组位置、表达丰度、转录本长度、保守性以及SNP分析发现,74%的lncRNA定位于基因间区域,16%为反向lncRNA,只有3%定位于基因内含子区域。新的lncRNA在转录本长度上比蛋白编码基因要短一些,却长于GENCODE的lncRNA。从保守性来讲,新的lncRNA保守性更差,相比较而言,外显子区域的保守性要强于内含子区域(图2)。


图2: 新lncRNA的鉴定。

肿瘤与PVTT中的lncRNA

      研究人员使用统计学的方法对肿瘤与PVTT的lncRNA表达模式进行了统计。结果发现,原发灶的lncRNA和正常组织相比表达量远比转移组织lncRNA的差异大得多(图3)。




图3: 肿瘤与PVTT中的lncRNA表达分析

lncRNA与公共临床数据库的分析

      通过将lncRNA测序数据与Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 数据库的数据比对后发现,测序的数据与公共数据库中的数据具有较好的一致性(图4)。


图4:lncRNA与公共临床数据库的比对。

      鉴于此,研究人员认为lncRNA可能可以作为肿瘤的生物标志物用于临床诊断。因此,研究人员筛选了其中一个lncRNA RP11-166D19.1并且应用于临床的生存率研究。结果发现,该lncRNA高表达的情况下,临床病人生存率显著升高。

图5:RP11-166D19.1作为生物标志物的研究。


lncRNA的CNVs与DNA甲基化研究


      研究人员对lncRNA还进行了CNVs以及甲基化的研究(图6)。对于CNVs的研究,研究人员使用了Affymetrix CytoscanHD芯片(该服务由伯豪生物提供)。给予GISTIC的分析,4个染色体位点显著扩增,70个染色体位点显著缺失(图6)。在这些染色体区段中,染色体位点显著缺失的区段中存在147个lncRNA,而染色体位点显著扩增的区段中则没有lncRNA存在。

      此外,研究人员还使用了DNA甲基化芯片(Illumina Infinium HumanMethylation 450 k服务由伯豪生物提供)对60个样本进行了甲基化检测。结果发现,93个lncRNA的表达和甲基化之间存在关联(图6)。其中,HAND2-AS1的启动子区域在肿瘤细胞中存在超甲基化情况(图6)。

图6: lncRNA的CNVs与DNA甲基化研究

lncRNA共表达网络构建

      为了预测lncRNA的功能与调控机制,研究人员构建了lncRNA与其互作的蛋白编码基因的调控网络图(图7)。在预测到的43个网络簇中,有4个簇中肿瘤相关的lncRNA显著富集(图7)。其中,第25个簇中的蛋白编码基因包括了和肿瘤转移相关的细胞粘着以及TGF-b通路。并且,很多肝癌驱动基因也富集在了这个网络中(图7)。

图7: lncRNA共表达网络构建。

肿瘤转移相关的lncRNA功能研究

      为了研究单个lncRNA对肝癌的调控关系,研究人员挑选了10个在之前研究中认为和肝癌相关的lncRNA,并对其进行了RNAi沉默(图8)。结果发现,RP11-166D19.1,HAND2-AS1以及XLOC_015969的RNAi细胞系均表现出了不同的对肿瘤细胞的影响(图8)。

图8: 肿瘤转移相关的lncRNA功能研究

小结

长久以来,肿瘤的生物标志物一直都是较多的局限于对蛋白编码的基因的检测。而在本工作中,研究人员通过对肝癌细胞的lncRNA转录组测序与CNVs以及甲基化检测,确认了在肝癌细胞中新的lncRNA同样具有生物标志物的潜在临床价值。

原文出处:
Yang Y, Chen L, Gu J,et al. Recurrently deregulated lncRNAs in hepatocellular
Carcinoma. Nat Commun.2017.
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