安诺转录组文章6连发,666~
2018全球硬科技创新大会生物技术论坛
做实验,得iPhone!

4位国内外大牛齐授血液DNA、RNA、蛋白研究秘诀

2017/03/19 来源:解螺旋/子非鱼
分享: 
导读
每个细胞都是一座城,城中则挤满了核酸分子和蛋白质等原住居民。血液作为绕城而行护城河滋养着每座城的同时也积淀着大量的宝藏。无奈,对外来移民的安检(检测)方法一直都处于探索阶段,很难统一标准化。


每个细胞都是一座城,城中则挤满了核酸分子和蛋白质等原住居民。血液作为绕城而行护城河滋养着每座城的同时也积淀着大量的宝藏。小个子外泌体(30-100nm)、大块头微囊泡(1000nm)及细胞分泌物(核酸分子)等外来移民们不停地穿梭于护城河之中,并形成一股无形的纽带连接着每座城。

即是移民,其身上总会烙印着家乡(原活细胞)的印迹。比如偏爱护犊子的外泌体(exosome),它就将自家娃(蛋白质、RNA、DNA片段)保护的极好,随便单拎一个娃出来都成为故乡的最佳代表,而这完全归功于它对核酸酶、蛋白酶等危险因子不余遗力地扫地出门。它的这种拼尽全力的姿势,落在肿瘤细胞的眼里后深得其欢心,虽然它长时间不被人们所重视,却早已被肿瘤纳为在机体中转移探路的先锋部队。

好在亡羊补牢为时不晚,现阶段不少研究者正于护城河中挖宝追踪,并期冀撸清楚外来移民与肿瘤之间千丝万缕的关系,进而可以早期诊断或监测疾病。无奈,对外来移民的安检(检测)方法一直都处于探索阶段,很难统一标准化。因而The Scientist杂志的多位牛人分享了自家隔离外来移民的战略方针,并贡献出了相应的注意事项和实验技巧。

DNA甲基化图谱分析

研究者:香港中文大学的卢煜明(Dennis Yuk-ming Lo)教授,他是无创产前诊断的奠基人,一生致力于人体内血液的DNA研究,并率先提出了在孕妇血液中检测胎儿DNA的理论。(大家是不是很熟悉呀,没错,他就是去年获得首届未来科学大家的科学界男神卢煜明,我们曾对他进行过报道哦,点击查看卢煜明和他的诗意人生。)

研究项目:常言道,爱美之心人皆有之。DNA也不例外,它在表观遗传学的“装饰包装”之下变得焕然一新,并深刻影响着细胞对基因表达的控制。因而,卢教授则千里追踪血源性DNA的甲基化图谱以检测异常循环DNA的器官来源。

研究成果:卢教授的研究团队利用全基因组重亚硫酸盐测序法研究了血浆DNA的甲基化模式,并从十四种不同组织(包括肝脏,血细胞,胎盘等等)的甲基化组中挖掘出5,820个带有足够组织信息的甲基化生物标记。随后他们利用生物信息学重迭解析处理(bioinformatics deconvolution process)方法,以辨别血浆DNA的组成百分比或组织图。而这幅血浆DNA甲基化模式的“鸟瞰图”可指出异常循环DNA的组织器官起源。

注意事项:血液中甲基化组会存在个体间的差异变化。另外,测序时重亚硫酸盐会破坏一些DNA而产生偏好性,因而,单分子测序等更灵敏的方法可有利于血液甲基化研究。

前景展望:卢教授认为分析血液中的组织特异性甲基化模式还会有更多的用途,比如追踪移植排斥或者鉴定循环肿瘤DNA的来源。其发表于PNAS杂志的一项研究则通过分析血液中的甲基化DNA,检测到了癌症患者的肝肿瘤和淋巴瘤,以及孕妇胎盘中的遗传异常;并为分子诊断与基于器官的传统医疗之间搭起了一道桥梁。

文献:Plasma DNA tissue mapping by genome-wide methylation sequencing for noninvasive prenatal, cancer, and transplantation assessments

外泌体蛋白检测

研究者:加州大学医学和免疫学教授Edward Goetzl

研究项目:都说“死别”是人生苦,可“生离”又何尝不让人肝肠寸断!阿茨海默症(AD)无情的侵蚀着挚爱亲人的生命色彩,并让他们遗忘了这个世界。因而,Edward Goetzl教授则期望通过追踪AD患者外泌体的β淀粉样蛋白和tau蛋白,来实现定期血检来监控AD患者的疾病历程。

研究成果:Goetzl的研究团队收集了AD患者确诊前后的血样,并通过System Biosciences公司的ExoQuick分离血样中的所有外泌体,再用结合神经元表面蛋白的抗体富集神经元外泌体,检测这些外泌体所含的蛋白质。研究显示,在阿尔茨海默症患者的神经元外泌体中,tau、磷酸化tau和β淀粉样蛋白的表达水平均显著升高。

注意事项:现在仍不确定血液中神经元外泌体的总量是否会随着疾病状态发生改变,因此,处理数据时,应在单个外泌体水平上进行分析。此外,为了避免外泌体中蛋白质降解,提取出外泌体后需要及时进行分析。

前景展望:2013年Goetzl与人合作建立了NanoSomiX公司,希望能开发出阿尔茨海默症血液测试,以提前10-15年鉴定疾病风险,让高风险人群使用预防性药物。

文献:Identification of preclinical Alzheimer's disease by a profile of pathogenic proteins in neurally derived blood exosomes: A case-control study

外泌体microRNA诊断

研究者:Illinois大学副教授Neil Smalheiser

研究项目:自美人miRNA摇曳着身姿住进了外泌体,使其蓬荜生辉不少,也引得众多研究者纷至沓来,只为求得与美人结一段缘。而这正是Neil Smalheiser所从事的研究工作,即从血浆外泌体中鉴定出AD患者的miRNA指标

研究成果: Smalheiser研究团队使用了分离外泌体的传统方法——差速离心(differential ultracentrifugation)逐渐洗掉游离RNA、蛋白聚合物和细胞残骸,只留下外泌体。再从外泌体中提取RNA及测序,并建立了成熟miRNA的数据集。随后即可通过计算模型鉴定了一组可以将阿尔茨海默症和对照准确分开的miRNA。

注意事项:超速离心难以实现高通量,也很难转化到临床中去。可利用Thermo Fisher Scientific公司的几款总外泌体提取试剂盒(Total Exosome Isolation Reagent)分别从细胞培养基、血清、血浆、尿液及其他体液中分离出完整的外泌体。另外,利用Trizol试剂提取RNA时,适量添加糖原可使RNA产量提升了将近23%,对提取低产量RNA是极其有利的。

文献:Plasma Exosomal miRNAs in Persons with and without Alzheimer Disease: Altered Expression and Prospects for Biomarkers

细胞外RNA诊断

研究者:加州大学圣地亚哥分校副教授Louise Laurent,美国转化基因组研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen

研究项目:Laurent和Keuren-Jensen作为美国NIH胞外RNA交流协会的成员,正在努力的推动循环miRNA检测的标准化,提升细胞外RNA研究的可重复性。因而,他们希望鉴定出胎盘功能障碍(Laurent)和大脑损伤(Keuren-Jensen)的循环miRNA指标。

研究成果:由于妊娠期间胎盘会将包含RNA的囊泡释放到母体血液中,因而Laurent希望从中鉴定出胎盘疾病的miRNA指标,比如子痫前期和宫内生长受限。其初步研究结果显示,母体血液中的外泌体和微囊泡都可以分离出妊娠特异性miRNA。妊娠后期的miRNA指标与胎盘组织的关系尤为密切。

而Keuren-Jensen研究团队则将监控撞击数据的感应器装在橄榄球运动员的头盔中,并在橄榄球赛季中收集运动员的血液、尿液和唾液样本。通过对这些样本进行RNA测序,寻找与撞击数据有关的生物学指标。同时,他们发现不同的商业化试剂盒会对细胞外RNA的收集造成很大的差异。

注意事项:从血浆或血清中分离出疾病相关RNA(exRNA)之所以具有一定的挑战性,一方面是因为exRNA丰度低,另一方面是因为血液中的污染物会抑制PCR。因而,简化和加速exRNA提取过程的商品化试剂盒便成为了循环exRNA研究不可缺少的工具。

而Van Keuren-Jensen认为利用“接头”(短片段DNA的粘性末端,可靶向结合扩增的目标分子)的测序试剂盒可能给实验结果带来很大的变数。接头的随机化,可与某些miRNA结合得更好;但有些接头二聚体比较少的试剂盒,其测序偏好比较大。因而,建议大家在论文中分享自己所用的试剂盒和分离方法,因为这些信息对实验结果的重复很有帮助。

另外,Laurent则认为减少样本批次、尽量由同一个人操作有助于降低结果的差异性。另外,在没有一个通用标准的情况下,设立内参有助于去除产量或批次差异带来的许多影响,可提高结果可重复性。

参考文章:Written in Blood

本网站所有注明“来源:生物探索”的文字、图片和音视频资料,版权均属于生物探索所有,其他平台转载需得到授权。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(editor@biodiscover.com),我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点,不代表本站立场。