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Nature新技术:CRISPR 单细胞测序=?

2017/02/05 来源:生物通
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导读
哈佛大学,Broad研究院的研究人员提出了一种解决方法:他们将CRISPR筛选与文库筛选结合起来,通过整合CRISPR基因组编辑与单细胞RNA测序,平行确定多个基因的基因调控影响,在单个实验中研究数千个单细胞。


CRISPR-Cas9“基因剪刀”的基因组编辑技术是生物研究和新型靶向药物研发的有力工具。比如利用CRISPR筛选基因(pooled CRISPR screens),可以通过CRISPR gRNAs靶向成百上千个不同的基因,同时编辑许多细胞,然后实验筛选编辑细胞,gRNA可以帮助确定哪些基因对于生物学作用机制具有至关重要的作用。

这种筛选方法对于解决与细胞生长能力直接相关的问题最有用,例如鉴定保护癌细胞免受化疗或免疫细胞抵抗HIV感染的基因。 相比之下,可能对于研究基因调控和其它复杂的生物机制并不是那么适合,因为要了解多个基因如何协同工作,调控调节细胞状态,就需要针对每个CRISPR靶向基因,分别进行培养,编辑和分析细胞,一看就知道既繁琐,又昂贵。

来自哈佛大学,Broad研究院的研究人员提出了一种解决方法:他们将CRISPR筛选与文库筛选结合起来,通过整合CRISPR基因组编辑与单细胞RNA测序,平行确定多个基因的基因调控影响,在单个实验中研究数千个单细胞。

这一研究成果公布在1月18日的Nature Methods杂志上,领导这一研究的是Christoph Bock教授,其研究组利用了尖端的分子技术,构建了一种能帮助研究人员看到单细胞测序实验中的CRISPR gRNAs的病毒载体,并采用了最先进的基于液滴的单细胞RNA测序方法,高通量的分析了单细胞中上千个基因组编辑事件的影响。

CROP-seq(CRISPR droplet sequencing,CRISPR液滴测序)创造性地组合了基因组学领域两个最有希望的技术,能大规模完成前所未有的高通量基因调控的分析。此外,随着单细胞测序成本的下降,这种技术还可以生成人类基因组中23,000个基因的每一个基因调控影响的综合图谱。

“我们利用CROP-seq研究了白血病发生过程中的遗传和表观遗传因素的相互作用”,Christoph Bock说,“如果能在试管中了解癌细胞生成所需要的元件,那么就可以找到新的方法来干扰癌细胞生成,将细胞恢复到更有利的状态。”

CROP-seq目前作为开源方法开放,所有数据,指南,试剂和软件将由CeMM自由共享,其他科学家可以在自己的工作中使用和扩展该方法。

随着二代测序技术的飞速发展,带动了众多基于测序技术的高通量测序数据呈爆炸式增长,然而传统的高通量测序技术均以细胞群体作为研究对象,实际上细胞群体内各个细胞间存在异质性,细胞群体内细胞状态相同的这个假设并不完全成立。

近年来,单细胞测序技术蓬勃发展,基于以上单细胞测序技术,回答细胞群体间细胞异质性的问题成为可能,然而单细胞测序技术在时间花费与并行通量上的缺陷仍然限制着针对这一问题的研究与发展。基于液滴微流控分选细胞(Droplet)的基因组学与表观遗传组学技术有效的弥补了传统单细胞测序由于细胞筛选导致的不足。

一些生物技术公司已经开始向这些方面倾斜,如去年Bio-Rad公司和Illumina公司达成合作协议共同开发针对单细胞的新一代测序工作站,这种新型仪器将利用公司的核心微滴分区技术来包裹细胞;在细胞裂解及细胞RNA同微滴中的珠子进行杂交后,乳浊液就会破碎,而且在一系列的样品准备步骤后,混合液就会进入到一种由Illumina公司开发的无菌文库准备过程中。

原文检索:

Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout

Authors: Paul Datlinger, André F Rendeiro, Christian Schmidl, Thomas Krausgruber, Peter Traxler, Johanna Klughammer, Linda C Schuster, Amelie Kuchler, Donat Alpar, Christoph

Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout

CRISPR-based genetic screens are accelerating biological discovery, but current methods have inherent limitations. Widely used pooled screens are restricted to simple readouts including cell proliferation and sortable marker proteins. Arrayed screens allow for comprehensive molecular readouts such as transcriptome profiling, but at much lower throughput. Here we combine pooled CRISPR screening with single-cell RNA sequencing into a broadly applicable workflow, directly linking guide RNA expression to transcriptome responses in thousands of individual cells. Our method for CRISPR droplet sequencing (CROP-seq) enables pooled CRISPR screens with single-cell transcriptome resolution, which will facilitate high-throughput functional dissection of complex regulatory mechanisms and heterogeneous cell populations.

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