质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析
2017/01/17
质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析

质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析

【实验目的】

熟悉碱法提取质粒以及DNA的琼脂糖电泳分析的原理和方法。

【实验原理】(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)
在碱性条件下,染色体DNA发生变性,共价闭合的质粒DNA仍为自然状态。当溶液调至中性且有高浓度的盐存在条件下,变性的染色体DNA交联成不溶性的网格结构,变性的染色体DNA与蛋白质发生共沉淀,而质粒DNA仍存在于上清液中,通过离心去除沉淀,溶液中的质粒DNA可被异丙醇沉淀。

DNA在碱性的电泳缓冲溶液中因带负电荷,电泳时向正极移动,不同DNA的电泳迁移率与其分子长度与形态有关,DNA分子越大,则迁移率越小,因此,通过电泳可将不同长度的DNA分子分开。

【器材与试剂】

1.实验仪器   细菌培养箱,控温摇床,高压灭菌锅,微量移液器,高速台式离心机,电泳仪,水平电泳槽,紫外分析仪,pH计,微波炉

2.实验试剂  琼脂粉,100 mg/mL 氨苄青霉素钠,氯仿,异丙醇,70% 乙醇,琼脂糖,溴化乙锭,20 μg/mL RNase A, LB液体培养基,溶液I:50 mmol/L葡萄糖,10mmol/L EDTA, 25 mmol/L Tris-Cl缓冲溶液(pH8.0);溶液II:0.2 mol/L NaOH,1%SDS;溶液III: 3 mol/L 醋酸钾,5 mol/L 醋酸;TE缓冲溶液:10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/LEDTA;TAE缓冲溶液(50×):2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA,pH8.0;载样缓冲溶液(10×):0.25% 溴酚蓝,30%甘油。(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)

3.实验材料  转化pUC18的大肠杆菌(E.coli DH5α),λDNA/EcoR I, Hind III

【实验步骤】

一、质粒的提取

1.从平板上挑取转化pUC18的大肠杆菌的单菌落,接种于20 mL 含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,37℃,振荡(250 r/min)培养过夜。

2.取1.2 mL培养物置于Eppendorf管中,10 000 rpm离心1min,弃上清。

3.沉淀菌体用0.1 mL溶液I重新悬浮,加入0.2 mL溶液II,颠倒数次至溶液变得澄清,最后加入0.15 mL溶液III,轻轻颠倒Eppendorf管数次,10 000 rpm离心10 min。

4.上清液移入一个新的Eppendorf管中,加入0.2 mL氯仿,快速颠倒数次,10 000 rpm离心10 min,将上清液移入另一个Eppendorf管中,加入等体积异丙醇,混匀,10 000rpm离心10 min,弃上清。

5.向管中加入0.5 mL 70%乙醇,10 000 rpm,离心2 min,弃上清,室温挥干酒精,加入20 µL 含20 μg/mLRNase A 的TE缓冲溶液溶解DNA。

二、琼脂糖凝胶电泳(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)
1.称取1 g 琼脂糖,加入TAE缓冲溶液(1×)100 mL,微波炉加热熔化,配制 1%琼脂糖凝胶,稍微冷却后,倒入制胶模具,插好梳子,待胶凝固后,拔出梳子。

2.将凝胶连同制胶模具放入电泳槽,倒入TAE缓冲溶液(1×)使溶液没过胶面,取9 μL提取的质粒与1 μL栽样缓冲溶液混合,用微量移液器点加到凝胶的加样孔内。(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费送)

3.80~100 V 电泳,当溴酚蓝移动到距凝胶下边沿约25px处时,停止电泳。

4.将凝胶浸泡在含0.5 μg/mL溴化乙锭的TAE缓冲溶液(1×)中染色30 min,于紫外分析仪内观察结果。

【注意事项】(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)

1.质粒提取过程中,加入溶液II和溶液III后,要混匀,但动作要轻缓。

2.  质粒沉淀后,由于量比较少,贴在管壁上,在洗涤时不要将其移走。

 

 

 

 

 

 

 


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