植物总RNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析
网络 · 2017/01/17
植物总RNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析

植物总RNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析

【实验目的】

熟悉植物总RNA提取及提取RNA质量的琼脂糖凝胶电泳分析方法。

【实验原理】

用含有异硫氰酸胍变性剂的提取液抽提植物组织粉末,一方面可以和β-巯基乙醇联合作用高效抑制RNase的活性,防止RNA的降解,另一方面又可使蛋白质变性并使其溶解,在酸性条件,提取液进一步经过酚/氯仿抽提去除蛋白质、DNA、多糖等杂质,(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费送)RNA可被异丙醇沉淀。

【器材与试剂】

1.实验仪器  高速冷冻离心机,陶瓷研钵,液氮罐,微量移液器,电泳仪,电泳槽,紫外分析仪,水浴锅,烘箱(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)2.实验试剂  提取液:4 mol/L异硫氰酸胍,25 mmol/L柠檬酸钠(pH 7.0),0.5% 十二烷基肌氨酸钠,0.1 mol/L β-巯基乙醇;醋酸钠溶液(2 mol/L ,pH 4.0),水饱和苯酚(pH 3.5),氯仿/异戊醇(24:1,v/v),乙醇,异丙醇,焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,简称DEPC),琼脂糖,甲醛,10×电泳缓冲溶液:200 mmol/L吗啉代丙磺酸(pH7.0),20 mmol/L醋酸钠,10mmol/L EDTA(pH8.0),过滤除菌后避光保存;5×载样缓冲溶液:16 μL水饱和溴酚蓝,80 μL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0),720 μL 37%甲醛,2 mL甘油,3.084 mL甲酰胺,4 mL 10×电泳缓冲溶液,加DEPC处理过的水至10 mL,4℃保存;0.5 μg/mL溴化乙锭染色液(1×电泳缓冲溶液配制)

3.  实验材料新鲜的烟草叶片

【实验步骤】一、RNA的提取
1. 取两只10 mL离心管,各加入3 mL冰冷的提取液,置于冰上。
2. 取0.5 g新鲜的烟草叶片组织放在液氮预冷的研钵中,(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装 )倒入液氮,迅速研磨成粉末。3. 将粉末移入盛有提取液的离心管中,振荡,使植物材料和溶液充分混合,后将离心管置于冰上。
4. 向离心管中依次加入0.3 mL醋酸钠溶液、3 mL水饱和酚和1 mL氯仿/异戊醇,快速颠倒离心管数十次,冰上放置15 min。
5. 4℃,12 000×g离心30 min, 将上层水相转移到另一个离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀,-20℃静置30 min。
6. 4℃,12 000 ×g离心20min,弃上清,倒置离心管使溶液尽可能流干,沉淀重新溶于0.7 mL提取液,4℃,12 000 ×g离心10min,上清移入一1.5 mL Eppendorf管中,加入等体积的异丙醇,混匀后,-20℃静置30 min。
7. 4℃,12 000×g离心30min,弃上清,沉淀用70%乙醇润洗一次,用微量移液器吸走乙醇溶液,室温放置使残留乙醇挥发干净,加入50 μL DEPC处理的水溶解,得RNA溶液。

二、变性琼脂糖凝胶电泳

1.称取1.5 g 琼脂糖,加入DEPC处理的水72 mL,加热溶化后,冷却到50~60℃,再依次加入10×电泳缓冲溶液10 mL和甲醛18 mL,混匀后制胶。

2.取16 μL RNA溶液放入一Eppendorf管中,加入4 μL 5×载样缓冲溶液,65℃保温5 min,迅速置于冰上,上样前短暂离心。

3.点样后,80V恒压电泳,溴酚蓝迁移超过凝胶的1/2处时停止电泳。

1.凝胶用溴化乙锭染色液染色30 min,紫外等下观察。

【注意事项】(Q往圣科技3452125268提供免费基因慢病毒包装)

1.为尽可能的避免RNA的降解,实验所用玻璃器皿洗净后必须于烘箱内于180℃烘烤8 h以上,所用的溶液及塑料器皿必须用DEPC处理,操作环境尽量干净。

2. 为了减少RNase污染并避免DEPC、溴化乙锭、甲醛等对人体的毒害,实验过程中应戴手套操作,并经常更换。

 


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