大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
网络 · 2017/01/17
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化

大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化

【实验目的】
熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。

【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时,用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞,细胞膨胀成球形,可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态(感受态),处于此状态的细胞称为感受态细胞(competent cells)。此时,若在感受态细胞中加入质粒,则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面,经过42℃短暂的热激处理后,DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞,(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)在不含抗生素的培养基中短暂培养,使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达,在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌(含质粒)与未转化细菌分开,转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落,而未转化的细菌则不能。(你提供质粒和细胞,我给你免费构建稳定表达细胞系Q往圣科技3452125268)【器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)1.实验仪器  培养箱,恒温摇床,超净工作台,低温台式离心机,分光光度计,水浴锅,高压灭菌锅,微孔滤器(含0.22μm滤膜),酒精灯 (标本检测,你提供标本,我免费给你做实验,成果归你享有Q往圣科技3452125268)2.实验试剂 氯化钠(AR),无水氯化钙(AR),蛋白胨,酵母提取物,1.0 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,琼脂粉,LB液体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g, 800 mL蒸馏水溶解后,(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费基因慢病毒包装)。用NaOH溶液调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min;

LB固体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g, 800 mL蒸馏水溶解后,用1.0mol/L NaOH调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL,然后加入琼脂粉15 g,121℃高压灭菌20min,分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基,当温度降至60℃左右时,加入1 mL氨苄青霉素溶液(100mg/mL),混匀,分别倒入无菌培养皿;CaCl2溶液:准确称取无水氯化钙11.1g,用双蒸水溶解,并定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min,4℃保存;氨苄青霉素钠溶液:准确称取氨苄青霉素钠0.5 g,用蒸馏水溶解并定容至5 mL,用微孔滤器过滤除菌后,分装于Eppendorf管中,-20℃保存。(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒加慢病毒包装)3.实验材料 E.coli DH5α, pUC18质粒

【实验步骤】

1.接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中,37℃振荡(约250r/min)培养过夜。

2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中,37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4(约2 h)。

3.取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中,冰浴放置10~30 min,4℃,1 500×g离心5 min,弃上清。(你提供质粒和细胞,我给你免费构建稳定表达细胞系Q往圣科技3452125268)4.沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮,冰浴放置15 min,4℃,1 500×g离心5 min,弃上清。

5.沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮,放置在冰浴中,制成大肠杆菌感受态细胞。

6. 取5 µL pUC18质粒(不超过10 ng),加入制好的感受态细胞中,轻轻混匀,冰浴30 min。

7. 42℃热激90 s后,迅速置于冰浴5 min。

8. 加入800 µL培养基,37℃振荡(100 r/min)温育1 h,使pUC18上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。

9. 取200 µL涂布于含氨苄青霉素钠 (100 µg/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37℃培养箱中培养1 h,再倒置培养过夜至菌落清晰,统计菌落数量。

【注意事项】(标本检测,你提供标本,我免费给你做实验,成果归你享有Q往圣科技3452125268)

1.  应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞,OD600最好不超过0.4。

2. 整个实验最好在低温环境下进行,以获得较高的转化效率。

3.  每次悬浮沉淀细胞要轻缓,避免剧烈振荡。


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