CCK-8试剂盒
CCK-8试剂盒 WST-8 细胞增殖 细胞毒性,是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。 WST-8属于MTT的升级产品,能在电子载体1-甲氧基PMS的作用下被还原成水溶性甲臜产物,生成的甲臜量与活细胞数量成正比,因此颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值,可以反映活细胞数量。

检测原理

CCK-8试剂盒 WST-8 细胞增殖细胞毒性,是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-8属于MTT的升级产品,能在电子载体1-甲氧基PMS的作用下被还原成水溶性甲臜产物,生成的甲臜量与活细胞数量成正比,因此颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值,可以反映活细胞数量。

 

CCK-8法与普通的MTT法相比,具有显著特点:

★灵敏度高,数据可靠,重现性好

★操作简便,省时省力

★水溶性,不需要换液,尤其适合于悬浮细胞

★无需放射性同位素和有机溶剂,对细胞毒性低

★为1瓶溶液,毋需预制,即开即用

★适合于高通量药物筛选

CCK-8用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

保存条件:

4ºC避光保存一年有效, -20ºC避光保存两年有效。避免反复冻融。

 

CCK-8试剂盒操作说明

CCK-8溶液可直接加入到细胞中,不需要与其它组分预混。由于CCK-8溶液非常稳定并且细胞毒性很小,所以可以进行长时间孵育,例如孵育24-48小时。

在进行以下实验之前,可先设置空白对照孔,仅加入相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液,不加入细胞。

方法一. 制作标准曲线(测定细胞具体数量)

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞到培养板内。

2、按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每个浓度建议3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后按培养基体积的10%加入CCK-8试剂,培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。)

方法二. 细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃,5% CO2)。

2、向每孔加入10 μL CCK-8溶液。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

方法三. 细胞增殖-毒性检测

1、在96孔板中加入90μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。

2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱中孵育适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。

4、向每孔加入10μL CCK-8溶液。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

 

活力计算:

细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(不加药)-A(空白)] ×100

A(加药):具有细胞、CCK 溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白):具有培养基和CCK 溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0 加药):具有细胞、CCK 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力

 

注意事项:

1,由于使用96孔板进行检测,如果细胞培养时间较长,一定要注意蒸发问题。一方面,由于96孔板周围一圈最容易蒸发,可以采取弃用周围一圈的办法,改加相同量的PBS、水或培养液;另一方面,可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方,以缓解蒸发。

2,本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。培养基中酚红和血清的吸光度,在计算时通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

3,有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基页面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数。加完之后最好能够离心,以免CCK-8液滴悬挂在壁上。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定。

4,若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

5,建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。白细胞可能需要培养较长时间。若使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

6,若没有450nm的滤光片,可使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。

7,金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、CuSO4会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话,将会100%抑制。

8,本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 


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