综述 | 单细胞测序技术助力精准肿瘤研究
安诺基因 · 2016/11/04
随着高通量测序技术的发展,已经能够在单细胞水平对肿瘤细胞进行遗传突变和基因表达的准确检测。尤其,随着单细胞测序技术(Single Cell Sequencing,SCS)的出现与发展,能够对肿瘤单细胞的基因组学、转录组学和表观基因组学进行全面、精准的研究。

随着高通量测序技术的发展,已经能够在单细胞水平对肿瘤细胞进行遗传突变和基因表达的准确检测。尤其,随着单细胞测序技术(Single Cell Sequencing,SCS)的出现与发展,能够对肿瘤单细胞的基因组学、转录组学和表观基因组学进行全面、精准的研究。

美国德克萨斯大学MD Anderson癌症中心Nicholas Navin说:“单细胞测序技术是一项非常强大的技术,可以帮助我们发现肿瘤细胞里的基因组变异。”从疾病预后判断到病情监测,单细胞测序技术都将为肿瘤研究人员提供大量有效信息。众所周知,肿瘤细胞的突变速率非常快,且肿瘤组织是一种高度异质性的组织。确定肿瘤组织中存在哪些细胞亚群(或者叫克隆)具备转移能力,哪些克隆对化疗药物是敏感的,这些信息对于临床工作都非常有帮助。

SCS目前已经广泛应用于肿瘤细胞异质性研究、新突变位点的发现、肿瘤细胞克隆进化机制及相关新生物标记的鉴定;其应用于稀少肿瘤细胞(CTC细胞和扩散性肿瘤细胞)的早期发现和监控,有助于肿瘤的个性化和精准治疗[1-2]。

政策支持

今年3月8日,科技部下发了《国家重点研发计划2016年度项目申报指南》的通知,其中“精准医学研究”作为其中之一被列入优先启动的重点专项,指南中明确提出:要通过对单细胞组学技术的研发,建立单细胞的高通量快速分离、捕获、提取及测序技术;从而深入推进单细胞技术在重大及罕见疾病临床研究和治疗中的应用。

作为上述研究的目标和基础,建成“单个细胞基因组的均匀、无偏、精准扩增和高通量测序技术”和“整合的单细胞多组学高通量测序技术”等内容被明确的提出将作为项目的考核指标,相关领域研究在未来五年将受到国家重点扶持。

单细胞多组学技术

一、单细胞分离技术

依据肿瘤单细胞的表型和生物标志物,能够筛选出完整的肿瘤单细胞。

主要分选方法:

有限稀释法(Limiting Dilution);

显微操作法(Micromanipulator);

激光显微切割(LCM);

流式细胞分选(FACS);

微流控技术(Microfluidics)。



图1. 单细胞分选方法[3]

随着单细胞测序技术发展,近几年出现大规模单细胞分选平台:

2016年,10X Genomics推出Single Cell 3' Solution,一次分选上万个单细胞,特别适合大量肿瘤单细胞的精准研究。

2015年WaferGen推出ICELL8 Single-Cell System,每次运行可分离500-1000个细胞,大幅降低肿瘤单细胞转录组测序研究的成本,在肿瘤单细胞精准研究有很大的应用前景。


图2. 10X Genomics的Single Cell 3' Solution分选平台

二、单细胞测序技术

1) Single Cell Genome Sequencing(单细胞全基因组测序)

目前主流技术涉及MDA(Multiple Displacement)和MALBAC(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles)两大扩增技术,对分离的单细胞中微量全基因组DNA进行高效扩增后进行测序,获得细胞中的遗传变异信息,用于揭示癌症发生、发展,细胞群体差异和癌细胞进化关系。

应用方向:

a. 寻找肿瘤相关的基因突变位点

肿瘤的形成源自于基因突变,这类突变最终导致正常细胞向表型异常的细胞转变;寻找不同肿瘤分型及不同阶段的基因突变位点,有助于理解肿瘤的演化机制,应于肿瘤精准诊断和治疗。

b. 肿瘤细胞克隆进化机制研究

肿瘤细胞的克隆进化会涉及到基因的累积突变,这种突变会破坏细胞的正常功能并且促使肿瘤过渡到一个新的表型。美国德克萨斯大学的研究人员[3]利用单细胞基因组测序技术研究三阴性乳腺癌肿瘤细胞的遗传突变,基于遗传突变位点构建肿瘤细胞克隆进化树,进一步研究肿瘤的克隆进化机制,可用来预测肿瘤侵袭、转移和病人生存率。

c. 肿瘤的无创诊断及治疗

基因的累积突变可以导致肿瘤形成的同时,也可以调节肿瘤细胞对治疗的反应。2013年,北京大学研究人员[4]利用单细胞测序技术识别癌症诊断相关的的关键靶点,这些靶点相关的小分子往往可以用于肿瘤的个性化治疗,这为肿瘤的无创诊断和治疗提供了一种新的技术手段。

2) Single-Cell Whole Transcriptome Sequencing(单细胞全转录组测序)

2013年9月,《Nature Methods》[5]发表的Smart-seq2技术,该技术能够满足高敏感度、无偏好性的cDNA转录本的扩增,也能够富集完整全长的转录本,并且可以维持原始mRNA各转录本的丰度。研究单个细胞内的整体基因表达情况,以及基因的结构变异。

应用方向:

a. Science——脑胶质瘤细胞异质性

脑胶质瘤是人类致死性最高的恶性肿瘤之一,也是异质性最为典型的肿瘤。目前将胶质母细胞瘤分为4个亚型,在单细胞水平对不同分型的脑胶质瘤细胞进行瘤内异质性检测是本文的重点。


图3. 脑瘤胶质瘤单细胞的分选方法[6]

利用流式细胞术的方法,对来自5位患者的脑胶质瘤细胞进行分选,并对获得的单细胞进行RNA-seq检测,并深入分析了共430例细胞的数据,精细绘制了肿瘤细胞的组成图像。揭示每个胶质母细胞瘤都包含来自多种癌症亚型的细胞,肿瘤之间这些细胞的分布各不相同。


图4. CNV与DMS分析

Science——前列腺癌耐药机制


图5. 前列腺癌CTC细胞分选及细胞学鉴定[7]

去势疗法(ADT)是前列腺癌的常见治疗手段,但是癌症复发后AR(androgen receptor,雄激素受体)抑制剂的疗效因人而异。来自哈佛医学院的研究者通过简单的液体活检,获取CTC细胞(循环肿瘤细胞)进行单细胞RNA测序分析,揭示了前列腺癌的耐药机制。


图6. 前列腺癌CTC产生耐药性机理分析

研究人员从13位出现雄激素抵抗 (AR)的患者体内收集了77份循环肿瘤细胞,并完成了总RNA序列分析。通过比对出现AR的患者血样循环肿瘤细胞,与未进行治疗患者样品,发现AR抗性组出现了nc-Wnt信号通路被激活的现象;而nc-Wnt信号通路是众所周知的调控细胞生存,增殖与运动功能的信号途径,从而调控癌细胞耐药机制。

Science——黑色素瘤复杂细胞环境研究


如今在整个生物领域中正被用来研究一个共同的问题:如何研究异质细胞群体中的细胞多样性。这种多样性能够对细胞存活和增殖、对药物疗法和干预作出的反应以及很多其他的生物过程产生深刻影响。单细胞技术用来研究癌症组织---一种多样性的复杂细胞环境。


图7. 单细胞基因表达鉴定黑色素瘤和非黑色素瘤细胞类型[8]

对19名黑色素瘤病人的单细胞样本进行测序,共计4645个不同的肿瘤细胞;类型包括了恶性肿瘤细胞,免疫细胞,间质细胞和内皮细胞。发现:在同种肿瘤中的恶性细胞,其转录的异质性与细胞周期,空间分布和抗药性相关。

通常,恶性黑色素肿瘤具有以下两种特征:高表达MITF转录因子,或低表达MITF转录因子同时具有较低的AXL受体络氨酸激酶水平。MITF是皮肤中黑色素细胞的主要调节基因,在药物治疗中,容易被杀死,而不被药物治疗杀死的肿瘤细胞AXL激酶高表达。


图8. 根据MITF和AXL表达水平的高低,对肿瘤组织进行分类,如B所示,可以分为4大类

3) Single Cell Whole Genome Bisulfite Sequencing(单细胞全基因组甲基化测序)

DNA甲基化目前已成为多种肿瘤诊断和预后的生物标志物;尤其在单细胞水平研究全基因组范围内的甲基化水平,对高异质性细胞表观遗传信息的发掘有重大意义,为揭示癌症的发生、发展机制,细胞异质性,癌症的早期发现和预后效果评估以及进行癌症的研究治疗提供了可能。

2014年7月,《Nature Methods》[9]发表了利用单细胞全基因组甲基化测序技术来获得单个细胞全基因组的甲基化水平,从而研究胚胎的发育机制和癌症细胞的异质性,这使我们能够进一步理解胚胎的发育机制,也更好的进行癌症和不孕不育的治疗。

安诺基因作为国内唯一一家成功搭建单细胞全基因组甲基化测序平台的公司,通过公司研发团队的不断研发与测试,技术的各个环节得到优化,文库成功率达到100%以上,已经开展人、小鼠和大鼠等物种的相关研究。具体技术路线如下。


图9. 单细胞全基因组甲基化技术路线

4) Single-Cell Genome and Transcriptome Sequencing(G&T-seq)

2015年4月27日,《Nature Methods》[10]杂志上发布了单细胞G&T-seq技术(单细胞基因组和转录组平行测序技术,parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes),该技术实现了对单个细胞内的DNA和RNA平行测序,能够展现单个细胞的基因变异与基因功能之间的关系,这个技术可以分析单细胞基因型和表现型之间的关系,深刻揭示一个细胞内的DNA信息指导细胞状态的调控机制,真正实现了对同一个细胞在一个时空内遗传物质的综合研究。


图10. 单细胞G&T-seq原理

对于单细胞G&T-seq技术来说,其最大的难点就是在mRNA和DNA分离的过程中,最大限度的减少mRNA和DNA的损失;针对这个技术缺陷经过长时间的优化,取得重大突破:利用Smart-seq2进行扩增获得转录组测序数据,其与基因组mapping率达到90%以上,能够检测到10,000~12,000个基因表达;利用MDA和MALBAC两种方法捕获基因组数据,基因组覆盖度能够达到90%以上。

表一. 单细胞转录组数据

表二. 单细胞基因组数据

单细胞G&T-seq技术应用方向:

肿瘤细胞精准研究

近年来,利用单细胞单组学测序技术对肿瘤细胞进行细胞异质性研究、新突变位点的发现、肿瘤细胞克隆进化机制及相关新生物标记的鉴定、以及耐药性产生机制等研究,单一组学研究已经很难满足肿瘤细胞的精准研究。研究人员利用单细胞G&T-seq技术研究同一个人乳腺癌细胞和正常细胞的差异,并发现染色体拷贝数和基因表达水平是正相关的,从2015年,安诺基因在国内率先搭建起此平台,这项技术将成为肿瘤精准研究的重要应用方向。

希望之路

近几年的研究,单细胞测序技术已应用于在几大癌种致病机理的研究。其中在乳腺癌和结直肠癌,肌层浸润性膀胱癌,肠癌,肺腺癌,肾癌和急性髓性白血病等这些疾病在致癌机理、病情发展、转移、耐药性等的研究得到了前所未有的成果。这也预示着单细胞测序技术在未来肿瘤精准研究与治疗的应用前景。

需要特别提出的是,单细胞测序技术分析循环肿瘤细胞(CTC)揭示了肿瘤细胞异质性和其耐药机制的机理,这些结果可以显著改善癌症治疗效果,促进CTC成为无创癌症诊断、监测和精准治疗的重要手段。

需要突破的困局

目前,单细胞测序在肿瘤精准研究中还处在非常初级的阶段,也面临很多技术的挑战。安诺优达作为国内这一技术的绝对领先者将紧跟其国际的前沿动态,助力单细胞多测序技术在肿瘤精准研究的突破。

参考文献:

[1] Sun H, Chen J, Ni B,et al. Recent advances and current issues in single-cell sequencing of tumors[J]. Cancer letters, 2015, 365(1): 1-10.

[2] Zhang X, Marjani S L,Hu Z, et al. Single-Cell Sequencing for Precise Cancer Research: Progress andProspects[J]. Cancer research, 2016, 76(6): 1305-1312.

[3] Wang Y, Waters J,Leung ML, et al. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing[J]. Nature, 2014, 512(7513): 155-160.

[4] Ni X, Zhuo M, Su Z, etal. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients[J]. PNAS, 2013, 110(52): 21083-21088.

[5] Picelli S, Björklund ÅK, Faridani O R, et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells[J]. Nature methods, 2013, 10(11): 1096-1098.

[6]Anoop P Patel et al.Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity [J].Science, 2014, 344(6190):1396-401

[7]Miyamoto D T, et al.RNA-Seqof Single Prostate CTCs Implicates Noncanonical Wnt Signaling in AntiandrogenResistance[J].Science, 2015, 349(6254):1351-6

[8] I Tirosh, et al. Dissectingthe multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq[J].Science, 2016, 352(6282)

[9] Smallwood S A, Lee HJ, Angermueller C, et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing forassessing epigenetic heterogeneity[J]. Nature methods, 2014, 11(8): 817-820.

[10] Macaulay I C, HaertyW, Kumar P, et al. G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes andtranscriptomes[J]. Nature methods, 2015, 12(6): 519-522.

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本文转载于测序中国。

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