毕氏酵母(Pichia pastoris)感受态细胞制备及转化
易生物实验 · 2010/07/19
1、毕氏酵母氯化锂转化法 (1)试剂 1M LiCl(用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释) 50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装) 2mg/ml salmon sperm DNA

1、毕氏酵母氯化锂转化法

(1)试剂

1M LiCl(用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释)

50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装)

2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存

注:醋酸锂对毕氏酵母无效,仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;

(2)感受态毕氏酵母的制备

接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中,30℃摇菌过夜(约24~28h)培养到OD值为0.8~1.0(约108 Cells/ml);

收获细胞,用25ml无菌水洗涤一次,室温下1500g离心10min;

重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中,将悬液转入1.5ml离心管;

离心机最大速度离心15秒沉淀菌体,重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中;

按50ul/管分装,立即进行转化;

注:不要将感受态酵母菌冰浴;

(3)毕氏酵母的转化

煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min,迅速冰浴以制备单链担体DNA;

将感受态酵母菌离心,以Tips去除残余的LiCl溶液;

对于每一个转化,按以下顺序加入:

50% PEG3350 240ul

1M LiCl 36ul

2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul

5~10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul

剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min);

30℃水浴孵育30min;

42℃水浴热休克20~25min;

6000~8000rpm离心收集酵母菌体;

重悬酵母于1ml YPD培养基,30℃摇床孵育;

1~4h后,取25~100ul菌液铺选择性培养基平板,于30℃培养2~3天鉴定;

2、毕氏酵母PEG1000转化法

(1)试剂

缓冲液A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol

缓冲液B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35

缓冲液C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35

未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存

注:

缓冲液A、B、C均用滤膜过滤,-20℃保存;

将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按6样品/组进行);

(2)待转化毕氏酵母的制备

接种环接种Pachia pastoris于YPD平板,30℃培养2d;

挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中,30℃振荡培养过夜;

取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养,待其OD值从0.1升到0.5~0.8;

室温下3000g离心收集酵母菌体,50ml缓冲液A洗涤一次;

重悬菌体于4ml缓冲液A中,按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷冻,

-70℃保存

(3)毕氏酵母的转化

将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中,直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率;

37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次;

取出离心管,加入1.5ml缓冲液B,彻底混匀;

30℃水浴孵育1h;

室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中;

离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中;

将所有转化液铺于选择性平板,于30℃孵育3~4天后,鉴定;

3、毕氏酵母电转化法

(1)E.coli TOP10F’感受态细胞的制备

取10ul TOP10F’菌液,接种于200ml LB液体培养基中活化培养,37℃,200 rpm,16~18小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。

37℃,200 rpm,培养16~18小时。

灭菌500 ml离心管,4℃,4000 rpm,20 min。得菌体沉淀。弃上清,菌体用10%甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。

第三次离心后,弃绝大部分上清,留下约1ml 液体用于重悬菌体。

从制得得感受态细胞中,取200ul于灭菌EP管中,加入连接反应产物5ul,混匀,不要产生气泡,在冰上放置5min。

将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。

使用电击穿孔仪进行转化,设置为电压 2500 V,时间 5 ms。

电击后,往电击杯中加入 800ul SOC培养基,冲洗出菌体,转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃,150 rpm ,轻摇45~60 min。

取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB-Zeocin平板上,正放,待涂布液不在流动,37℃ 培养12~16小时。

(2)线性化质粒DNA对Pichia pastorisGS115的转化

取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中,使其完全解冻;

1)将100μl菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中,加入5-20μg线性化质粒(5~10μl),轻弹混匀,尽数吸出转移到0.2cm 型的电穿孔转化杯中;

2) 转化杯置于冰浴中5~10分钟,保持低温。

3) 电穿孔转化电击条件:电压:1500V;电阻:400Ω;电容:25μF;脉冲时间:10mS;一次电击。

4) 电击后,马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液,用微量移液枪吹打均匀,置于冰浴中;

5) 取30℃烘至表面半干的MD培养基平板,在超净工作台上无菌操作涂布平板,400μl/板

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